解密|pH依赖性的BCS2类药物，如何建立体内外相关的溶出方法，以降低BE风险？

低溶解性、高渗透性药物，即生物药剂学分类系统（BCS）II类药物的溶出是口服吸收的限速步骤^（1-3）。弱酸性BCS II类药物卡维地洛（结构式见图1）在从胃液到肠液转运过程中，在不同pH值部位会表现出复杂的溶解度，如在胃部（较低pH值）有利于其解离和完全溶解^（4），而到达肠液（较高pH）后，由于其较低的溶解度可能会产生沉淀^（4,5）。卡维地洛是非选择性β受体阻滞剂/α-1阻断剂，用于治疗轻度至严重充血性心力衰竭和高血压，其LogP 值为3.8，碱性 pKa为7.8^（6），酸性pKa为15.0（ChemAxon软件计算）。

卡维地洛的溶解度呈pH值依赖性^（7）。卡维地洛在胃部酸性pH值条件下通过电离的形式溶解。然而，在碱性pH值下，卡维地洛在远端小肠处可能发生沉淀的^（6,8,9）。例如，Stillhart等人研究表明，有78.2-91.8％的卡维地洛以结晶或无定型形式沉淀^（9）。由于其水溶性差，卡维地洛的生物利用度很低^（10,11）。通过GastroPlus™  Simulation软件预测，卡维地洛的口服吸收约为45.9％^（6）。

通常，BCS II类药物的溶出度受很多生理因素的影响，如胃肠液的pH值、离子强度、缓冲容量是影响药物释放的三大因素^（2,12）。

空腹状态下，胃液的pH值为1.4-2.1，进食后，pH值立即增加至pH3.0-7.0（取决于食物组成）。胃液的离子强度约在0.051-0.151mol/L范围内，均值为0.095mol/L^（13）。胃液在禁食状态下的缓冲容量为0.013-0.019M /ΔpH^（14），进餐后约为0.028M /ΔpH^（15）。

小肠内的pH值从十二指肠到回肠逐渐升高，范围为pH5.5-8.3，取决于具体部位及是否进食^{（1,14,16）}。pH值的增加是由于胃酸中和胰腺所产生的碳酸氢根离子所致^（1,12）。肠液的离子强度在0.070-0.166mol/L范围内^（17）。人体肠液的缓冲容量在餐前和餐后分别为0.003和0.013M /ΔpH^（18）。Kalantzi等人研究发现十二指肠的缓冲容量餐前为0.006M/ΔpH，餐后为0.018-0.030M /ΔpH^（15）。

由于胃肠液的生理特性，如pH、离子强度、缓冲容量，会随食物的摄入或者不同位置而发生变化，因此，研究这些因素对弱碱性BCS II类药物在胃肠液中的溶解度和溶出行为的影响是很有意义的。本文的目的是以弱碱性BCS II类药物卡维地洛为例，研究其在模拟胃液和模拟肠液介质（pH为1.2-7.8）中的溶解度和溶出行为。此外，还研究了缓冲盐种类、离子强度、缓冲容量对Dilatrend速释片中卡维地洛的溶解度和溶出行为的影响。

这项研究有助于更好地理解弱碱性BCS II类药物卡维地洛在生理胃肠液pH范围内的溶解度和溶出行为，这将有助于我们了解这类药物在肠道内的溶出度和沉淀行为，并为建立体外-体内相关性的溶出方法提供指导。

2、用于溶解度和溶出度研究的介质

本研究中使用的模拟胃液和模拟肠液如下：

模拟胃液的溶出介质：

模拟肠液的溶出介质：

模拟十二指肠液的溶出介质：

本文中的空白是指配制溶出介质时，不添加酶、表面活性剂或胆盐。

除了药典标准介质外，模拟肠液配制采用了pH 6.8磷酸盐缓冲液，并配制了不同的缓冲液浓度（6.25、12.5、25、50和100mM）以获得具有可变离子强度和缓冲容量的溶出介质。磷酸盐缓冲液（100mM，pH 6.8）是根据Sigma-Aldrich Buffer Reference Center配制的。无离子强度和缓冲容量的双蒸水作为空白对照。pH7.2和pH7.8磷酸盐缓冲液也是根据Sigma-Aldrich Buffer Reference Center配制的，用于模拟回肠末端和模拟结肠的pH值。

本研究中用到的溶出介质的化学组成和理化性质（pH、离子强度和缓冲容量）见表I、II、III、IV。

3、溶出介质的理化性质

溶出介质的pH通过pH计测量，pH计在测量前需经校验。离子强度计算公式如方程（1）所示^（25）。

介质的缓冲容量用Van Slyke方程（2）来计算。

4、溶解度研究

所有介质中卡维地洛的溶解度测定方法为：在已装有50ml介质的烧杯中加入过量的卡维地洛，将烧杯置于水浴振荡器上，速度为50rpm，温度为37℃±1℃。通过校正后的pH计监控介质的pH值，如有必要调节至初始值。经1、2、4、6、24h后，取溶液5ml，以3500rpm离心15min，取上清液并用介质稀释至适当浓度，采用UV法在285nm处采用标准曲线法测定供试品中卡维地洛的浓度。平行制备三份样品，SD应小于10%。

溶解度（Cs）与药物浓度（C_D）的比值，Cs/C_D用来表示漏槽条件（S值）。根据USP规定，S大于3即符合漏槽条件（26）。卡维地洛在各pH值下的离子性百分数通过Henderson-Hasselbalch方程（3）计算。

5. Dilatrend片中卡维地洛的含量测定

Dilatrend片中卡维地洛的含量采用UV测定。

方法为：取10片，研细，精密称取约相当于卡维地洛25mg的细粉适量，置100ml量瓶中，加双蒸水10ml、甲醇-1M盐酸（9:1）混合溶液70ml，超声处理30min，放冷，用甲醇-1M盐酸（9:1）混合溶液稀释至刻度。样品溶液采用3500rpm离心15min，取上清液，用甲醇-1M盐酸（9:1）混合溶液稀释至合适的浓度，在285nm处测定吸光度，采用标准曲线法测定供试品中卡维地洛的浓度。平行制备三份样品。Dilatrend片已通过重量差异检查。

6. 溶出研究

采用已校验的溶出仪（方法2桨法）进行溶出测定。

转数为50rpm，介质体积为900ml，温度为37±0.5℃，在5、10、15、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240min自动取样，用0.45µm滤膜滤过。为了考察聚乙烯膜对卡维地洛的吸附，考察了卡维地洛粉末在0.7％HCl（USP38，pH1.45）介质中的溶出情况，取样量与Dilatrend片相似，溶出该条件与Dilatrend片相似。结果表明，过滤前后卡维地洛没有明显损失，回收率大于99.0％。

为了考察辅料是否干扰，配制了混合辅料，包括蔗糖、乳糖、聚维酮、交联聚维酮、二氧化硅和硬脂酸镁。在0.7％HCl（USP38，pH1.45）中进行了空白辅料考察，结果表明，在285nm波长处辅料无吸收，说明辅料无干扰。

Dilatrend片中卡维地洛的溶出量通过标准曲线计算，溶出介质的pH值在整个试验过程中进行监控，曲线的相似性通过相似因子f2进行评价，见公式（4）^（28）。如果f2小于50，说明溶出存在显著差异，如果f2在50-100之间，说明溶出相似。

1. 溶解度研究

卡维地洛在胃肠液生理pH值范围内50%~100%呈解离状态（见表V）。卡维地洛的高离解度，说明其与缓冲液中的阴离子成盐，这可能影响弱碱性药物的溶解度^{（10,11,29）}。因此，选择有阴离子的缓冲系统（缓冲盐种类）对卡维地洛的体外溶出度研究可能是重要的。

根据图1结构式可知，卡维地洛中咔唑的NH基是的酸性的，pKa为15.0（经ChemAxon软件计算）是因为孤对电子对芳构化的影响。因此，咔唑的N-H键很弱，氢容易水解成为H⁺（酸性质子）。相反，脂肪族仲胺是弱碱性的，pKa 为7.8^（6），这是由于受到周围氧原子的电负性和两侧芳香环上烷基的膨松性影响。卡维地洛的电离模式具有两性特征（具有酸性和碱性部分），在酸性pH值介质中，脂肪族NH被离子化形成阳离子中心，而在碱性pH介质中，咔唑NH被离子化形成阴离子中心。这种两性特征反映了其溶解特征。

卡维地洛（固体）对热（80℃下14天）、湿热（40℃/75％RH下14天）和紫外可见光（1.3×106lxh）稳定，在这些条件下，降解产物小于0.05％。

卡维地洛溶液在酸性（0.1N HCl，60℃4小时）、碱性（0.1N NaOH，60℃4小时）、紫外可见光（1.3×106 lxh，水）和热（60°C，水4 h）条件下，均没有大于0.06％的降解杂质产生^（30）。

另有研究表明^（31），卡维地洛固体和甲醇溶液在酸性溶液（1N HCl溶液，90℃6小时）、中性溶液（水，90℃6小时）和光解（UVC-254nm 30W灯，25℃7天）条件下，均无显著变化。但是，在碱性条件（1N NaOH，90℃，6小时）下会逐渐降解。

采用相同方法研究了卡维地洛在不同溶出介质（盐酸溶液，pH 1.2；酸性邻苯二甲酸酯缓冲液，pH 3.0；醋酸盐缓冲液，pH 4.5；磷酸盐缓冲液，pH 5.8、6.8、7.4）和水在37±0.5℃平衡24或48小时的溶解度^（32-34）。样品在溶解度分析过程中未避光。卡维地洛在所有介质中的饱和溶解度见表VI。

pKa为7.8的卡维地洛表现出典型的弱碱性药物的pH值依赖性，即在低pH值时有较高的溶解度，在高pH值时有较低的溶解度。值得的注意是，卡维地洛的溶解度在酸性介质中（pH1.2-5.0）1小时内即达到饱和，但在碱性介质（pH 6.5-7.8）中卡维地洛的饱和溶解度出现在24小时后。在pH值 6.8时，卡维地洛的溶解度在磷酸盐浓度为25、50和100mM时比磷酸盐浓度为6.25和12.5mM时少了约37%。

在高离子强度（盐浓度）溶出介质中，卡维地洛的溶解度低，这表明溶解度随着离子强度的增加而降低^（35,36）。在pH6.8介质中，尽管90%以上的卡维地洛以离子状态存在（见表V），但是由于形成了低溶解性的磷酸盐^（10），显著降低了卡维地洛在这些磷酸盐缓冲液中的溶解度。卡维地洛在pH 7.2介质中溶解度非常低。在pH 7.8时，溶解度比pH 6.8时下降了90％。卡维地洛在无离子强度和无缓冲容量的双蒸水中的溶解度也比在pH6.8介质中的溶解度下降了约45%。

研究结果表明，卡维地洛在酸性介质中更易溶解。这说明脂肪族NH的碱性比咔唑NH的酸性更强，这决定了它的溶解度。因此，脂肪族NH的碱性比咔唑NH的酸性更强，促进其在醋酸盐缓冲液（pH4.5）中的溶解度。在酸性介质中的溶解度是优选的，特别是在空腹状态下的pH值1.6和4.5。较高的pH值导致溶解度降低，如在pH 6.8磷酸盐缓冲液中所示。总之，酸性介质是完全溶解卡维地洛的首选介质。

卡维地洛计算的溶解度（C_S）和剂量（C_D）的比率（S值）在所有介质中均大于3，这表明它们均满足了漏槽条件。而S小于3，表明没有满足漏槽条件（见表VI）。卡维地洛在小肠内溶解度差，没有满足漏槽条件，说明了卡维地洛在小肠内沉淀。

2. Dilatrend片中卡维地洛的含量

Dilatrend片中卡维地洛含量为99.7±2.2%（n = 3），含量均匀度在98.5%~100.5%之间（n = 10）。

3. 溶出度研究

如图2所示，Dilatrend片剂中卡维地洛在酸性介质（0.7％HCl、SGFsp、空白FaSSGF和空白FeSSGF）为快速溶出，几乎可以重叠（f2>50）。溶出结果也与卡维地洛溶解度一致（表VI）。 因此，在餐前和餐后，卡维地洛能够快速溶出。

卡维地洛在60min内能够完全溶出且达到平台，在0.7％HCl、SGFsp、空白FaSSGF、空白FeSSGF中，累积溶出量平均值分别为95.8%、97.2%、97.4％和98.2％。虽然空白FeSSGF 的pH值比0.7％HCl、SGFsp和空白FaSSGF高（分别为5.0对1.5、1.2和1. 6），但卡维地洛仍然能够溶出完全。这可能是由于空白FeSSGF中存在醋酸盐缓冲液形成水溶性醋酸盐的缘故（10）。由于溶出介质的pH值比较低，离子强度和缓冲容量的影响并不明显，进一步说明在酸性介质中，pH值是影响卡维地洛释放最重要的因素。

同空白FeSSGF一样，溶出介质的缓冲液组成对药物的溶出有明显影响，其中醋酸盐增加了溶出速率。如图3所示，卡维地洛在醋酸盐缓冲液中溶出速率非常快，5min为约39.2％，在15min时基本全部溶出（97.4％）。 在pH 4.5醋酸盐缓冲液中，99.95％的卡维地洛呈质子化形式（表V）。Loftsson等人报道了质子化的碱与醋酸形成水溶性的盐，会导致溶解度增加^（10）。 因此，卡维地洛的溶出速率明显取决于溶出介质的pH值和缓冲盐种类。

空白FaSSIF（pH 6.5）与空白FeSSIF（pH5.0）的溶出曲线比较，空白FeSSIF溶出速率明显更快（f2=39.7）。然而在240min后，卡维地洛在两种介质中溶出量是相当的（约为86％）。卡维地洛在空白FeSSIF介质中溶出速率增加可以解释为它比空白FaSSIF有更低的pH值（5.0vs.6.5）。 此外，Loftsson等人报道，空白FeSSIF中存在醋酸盐缓冲液会增加卡维地洛的溶解度^（10），在空白FaSSIF中，NaCl和磷酸盐的存在导致形成不易溶解的盐酸盐和磷酸盐，从而降低了卡维地洛在空白FaSSIF中的溶出速率^（10）。

在模拟肠液SIFsp和0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）介质中，卡维地洛的释放量显著降低到70.2％和70.0％。卡维地洛的溶出曲线在SIFsp和0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）中是相似的（f2>50），这表明不同种类的两种缓冲液对卡维地洛释放没有影响。因为两种缓冲液的pH值和离子强度都是相当的（见表II），所以溶出曲线相似。虽然0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）的缓冲容量略高于SIFsp，但并没有观察到溶出曲线的差异，这与Dressman等人以前的研究一致，他也发现SIFsp可以与0.05 M磷酸盐互换使用^（37）。总的来说，醋酸盐缓冲液和空白FeSSIF比空白FaSSIF、 SIFsp和0.05M磷酸缓冲液（IntPh3）有更快的溶出速率。

通常，弱碱性药物在胃中有更快的溶出速率，它们在转运到小肠时会因为过饱和而发生沉淀。对卡维地洛而言，在十二指肠和餐后的肠道流体中会沉淀，这在卡维地洛在醋酸盐缓冲液（pH 4.5）和空白FeSSIF的溶出结果中可见一斑。然而，SIFsp和0.05M磷酸盐缓冲液（IntPh3）仍被普遍作为药典溶出介质^{（7,11,38-42）}。

为了更好理解卡维地洛在肠液中以及进入小肠后的沉淀行为，需要测定卡维地洛片在不同离子强度及缓冲容量的磷酸盐缓冲液中的溶出度。图4a比较了Dilatrend片中卡维地洛在不同缓冲液浓度（6.25、12.5、25、50和100mM）的pH 6.8磷酸盐缓冲液中的溶出曲线。磷酸盐缓冲液离子强度和缓冲容量的变化见表III。以卡维地洛在零离子强度和零缓能力的双蒸水中的溶出曲线作为参照，磷酸盐缓冲液的离子强度范围从0.013到0.200mol/L，涵盖了人体肠液的离子强度范围（0.070-0.166mol/L）^（17）。磷酸盐缓冲液的缓冲容量范围为0.003至0.047M/ΔpH，近似于人体肠液的缓冲容量（0.003-0.030M/ΔpH）^（15,18）。

卡维地洛在双蒸水中的溶出速率非常慢，240min仅溶出了36.2%。由于磷酸盐缓冲液的高pH值（pH6.8），卡维地洛未能完全溶出。卡维地洛在6.25、12.5、25、50和100mM缓冲液中的溶出量分别只有69.6、84.7、80.3、75.5和74.1％。卡维地洛在6.25mM磷酸缓盐冲液中溶出量最低，240min仅为69.6％。在6.25mM磷酸缓盐冲液中的溶出曲线与12.5、25、50和100mM缓冲液有显著差异（f2＜50），这是因为6.25mM磷酸盐缓冲液的缓冲容量低（0.003M/ΔpH）。已有研究表明，降低溶出介质的缓冲容量可以降低药物的溶解度和溶出速率^（43,44）。

当磷酸盐缓冲液中离子强度增加时，如12.5、25、50和100mM，在240min药物的溶出量分别为12.5mM（84.7％），25mM（80.3％），50mM（75.5％）和100mM（74.1％），溶出曲线没有显著性差异（f2＞50）。这些结果与Kincl等人关于双氯芬酸在各种离子强度的磷酸盐缓冲液中从亲脂性骨架片中的释放结果一致^（36）。Kincl等人发现，双氯芬酸的释放随离子强度的增加而降低。然而，当磷酸盐缓冲液具有较高的离子强度时（0.14-0.51mol/L），溶出曲线并无明显差异。溶出度数据与溶解度结果一致。卡维地洛在磷酸盐缓冲液离子强度为25、50和100mM时，溶出曲线没有明显差异（f2>50）。

尽管卡维地洛在离子强度为6.25和12.5mM磷酸缓冲液中的溶解度相当，但卡维地洛在12.5mM磷酸盐中的溶出速率明显高于离子强度6.25mM的磷酸盐缓冲液。这可能是由于12.5mM磷酸盐缓冲液的缓冲容量比6.25mM强。卡维地洛在12.5、25、50和100mM的磷酸盐缓冲液、SIFSP 和0.05M磷酸盐缓冲液（Int Ph3）中的溶出曲线没有显著差异（f2>50）。

为了确认磷酸盐缓冲液的缓冲容量在整个溶出度实验过程中保持一致（特别是低浓度6.25、12.5和25mM），对缓冲液的pH值进行了测定，见图4b。结果表明，pH值一直保持与初始pH值6.80接近，最大偏差为初始pH值的±0.05pH/min。因此，pH测量结果证实磷酸盐缓冲液12.5、25、50和100mM保持了其缓冲容量。在离子强度6.25mM的磷酸盐缓冲液中，pH值偏离初始pH值最大值达6.93，这表明初始pH值不能在整个溶出试验中持续保持。

为了进一步研究pH值对卡维地洛释放度速率的影响，进行了pH 7.2和7.8的100mM磷酸盐缓冲液中的溶出度研究。卡维地洛在这些介质中的溶出行为与pH 6.8的100mM磷酸盐缓冲液中的溶出行为进行了比较（见图5）。在pH 6.8中，卡维地洛在240min的最大溶出量约为74.1％；在pH 7.2中，溶出速率较慢，240min时仅溶出43.6％；在pH7.8时最慢，240min只有15.9％。这些结果表明，卡维地洛在远端小肠和结肠中有比较差的溶解度，使其不适合作为控释制剂^（11）。 卡维地洛在这些介质中的溶出结果与其溶解度数据一致（见表VI）。

本文着重研究了弱碱性pH依赖性BCS II类药物卡维地洛（pKa值为7.8）的溶解度和溶出行为。

• 卡维地洛在低pH值的模拟胃液中溶解度和体外释放量都很高，但在模拟肠液中溶解度和溶出度显著降低，表明在小肠中有沉淀。

• 卡维地洛的溶解度和溶出行为呈强烈的pH依赖性。

• 卡维地洛的溶解度和溶出度随着离子强度的增加而降低。

• 降低缓冲液的缓冲容量会导致卡维地洛溶解度和溶出度降低。

• 缓冲液的种类也显著影响卡维地洛的溶解度和溶出速率。
  

参考文献（略）