馆长听到了小伙伴们的呼唤快快的出现在你滴眼前！最近闲来无事想给小伙伴们找点新鲜玩意分享一下嘞，逛着逛着发现了一篇刚刚发表于Journal of Translational Medicine没几日的文章，相比于该期刊其它文献接受过程较缓慢，因此肯定本文在各方面应该是比较完美的状态啦！馆长细细看了一下，干湿结合，思路完整，迫不及待地要跟大家分享，且看馆长带你慢慢学习！
本文整合
GEO数据集
（GSE25097、GSE62232、GSE65372）来识别与HCC相关的差异表达基因（ERSRG），应用
随机森林（RF）和支持向量机（SVM）
机器学习技术筛选与
内质网应激
相关的ERSRG，并构建人工神经网络（
ANN）
诊断预测模型。还使用
ESTIMATE算法
分析ERSRG与免疫微环境之间的相关性，利用
药物特征数据库（DSigDB）
对ERSRG的潜在治疗药物进行研究。通过
单细胞测序
评估了ERSRGs中心基因PPP1R16A的免疫学景观，最后进行细胞学实验验证了其生物学功能，思路清晰完整，简直是个发文模板！
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题目：内质网应激通过调节免疫促进肝癌:一项基于人工神经网络和单细胞测序的研究
杂志：Journal of Translational Medicine
公众号回复“666”即可领取原文献，文献编号240804
肝细胞癌（HCC）具有
发病机制复杂、治疗方法有限、预后差
等特点。内质网应激（ERS）在HCC的发生发展中发挥着重要作用，因此需要进一步研究HCC和ERS的分子机制，以实现早期诊断和有希望的治疗目标。
首先整合
GEO数据集
（GSE25097、GSE62232和GSE65372）来识别与HCC相关的差异表达基因（ERSRG），应用
随机森林（RF）和支持向量机（SVM）
机器学习技术筛选与内质网应激相关的ERSRG，并构建
人工神经网络（ANN）
诊断预测模型。随后使用
ESTIMATE算法
分析ERSRGs与免疫微环境之间的相关性，利用
药物特征数据库(DSigDB)
探索了ERSRG的潜在治疗药物。最后通过
单细胞测序和细胞通讯
评估了ERSRGs中心基因PPP1R16A的免疫学景观，并通过细胞学实验验证了其生物学功能。
本研究在非批量删除和批量删除条件下对数据集GSE25097、GSE62232和GSE65372的基因进行主成分分析（图2A、B），结果表明成功消除了批次效应。图2C中的火山图显示HCC与正常组织之间存在
763个DEG
，其中
215个基因上调，548个基因下调
。图2D中的热图显示HCC和正常组织之间DEG的表达水平。
图3A通过312个ERSRGs和763个DEG交集得到1
1个ERS相关DEG
,使用RF分析进一步筛选了11个ERSRG。图3B残差图可以看出，当分支数为125时，残差最小。在RF树中对11个ERSRG进行评分，最终根据基尼系数降序选择
得分>20的7个ERSRG
（图3C）。如图3D所示，当11个ERSRG中有6个被保留时，均方根误差最小。通过RF分析中的7个ERSRG和SVM分析中的6个ERSRG的交集，得到SRPX、THBS4、CTH、PPP1R16A等，最终
确定THBS1
用于构建下图的人工神经网络(图3E)。
建立神经网络
，6个神经元
(SRPX、THBS4、CTH、PPP1R16A、CLGN、THBS1)作为输入层，2个神经元(HCC和正常组织)作为输出层(图4A)。
当隐藏层包含5个神经元时，模型的预测性能在训练组中最高
，AUC值为0.979(图4B)。在其他3个验证组中也对该人工神经网络预测模型的效率进行了评估。在GSE121248、GSE45267和GSE84005中，ANN模型的AUC值分别为0.958、0.936和0.970(图5C-E)。总之，该模型在预测HCC方面是一个潜在有力工具。
对6种ERSRGs在HCC和正常组织中的表达情况进一步研究，与正常组织相比，
HCC组织中CLGN、PPP1R16A和THBS4的表达水平显著升高
（图5A），近一步分析相互作用确定是共现还是互斥关系（图5B）。为探索ERSRGs促进HCC发生的潜在机制，分析了6种ERSRGs表达水平与免疫细胞浸润和免疫相关通路的关系（图5C），THBS1和SRPX与大多数免疫细胞和免疫相关通路呈显著正相关。最后使用ggcor和ggpplot2分析核心基因与两种免疫活性分子之间的表达相关性（图5D）。
Kaplan-Meier显示，
CLGN和PPP1R16A两种基因
低表达的HCC患者的总生存期明显长于高表达的HCC患者(图6A、C)。然而，SRPX、THBS1、THBS4高表达与低表达对HCC患者预后的影响无显著差异(图6D-F)。研究还分析了核心基因对应的启动子的甲基化状态，发现
CLGN、CTH、PPP1R16A、THBS1的启动子
甲基化程度在对照组和肝癌细胞组之间存在显著差异。CLGN的启动子甲基化水平在肿瘤组中较强，而其他三个基因的甲基化水平在肿瘤组中显著降低(图6H-M)。
UMAP图显示所有细胞都可以标注为
七种类型
，包括肝实质细胞、巨噬细胞等(图7A)，气泡图显示了七个不同注释细胞组中使用的标记基因（图7B）。单细胞分析显示
PPP1R16A主要在恶性肝实质细胞中表达
(图7C)，Go富集显示，PPP1R16A高表达的细胞主要与脂质代谢过程有关(图7D)。KEGG结果表明
PPP1R16A在肝实质中高度富集
（图7E），进一步聚类可知在所有重要的信号通路中，有7条通路具有聚类模块化特征，是更核心的信号通路(图7F)。
7.肝癌中PPP1R16A的上调和PPP1R16A的下调可显著抑制HCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力
QRT-PCR实验显示，与正常肝细胞相比，人HCC细胞系PPP1R16A表达更高(图8A)，
将siRNA转染到Hep3B和HCCLM3细胞中，选择最有效的sirna-ppp1r16a#1进行后续实验(图8B、C)。
CK8实验表明
，PPP1R16A敲低
可抑制
Hep3B和HCCLM3细胞的增殖能力(图8D)。同时，
划痕实验和Transwell实验表明
，敲低PPP1R16A可抑制HCCLM3和Hep3B细胞的迁移和侵袭能力。观察结果表明
PPP1R16A是HCC细胞的正调节因子
(图8E、F)。
