Nature | 脑内皮细胞糖萼失调，血脑屏障的“防护网”面临崩溃？

脑内皮细胞糖萼层是位于大脑血管内皮细胞表面的一层复杂网状结构，主要由蛋白聚糖、糖蛋白和糖脂组成（图1）。而血脑屏障 （blood–brain barrier, BBB） 不仅是血液与大脑之间的第一道屏障，还在细胞信号传导、粘附、运输和形态维持等方面发挥着重要作用。然而，尽管糖萼层对BBB功能的支持至关重要，但其组成和功能在稳态和疾病状态下的具体作用却知之甚少。

图1. 血脑屏障和脑内皮糖萼层示意图

首先，研究人员使用了多种实验方法来验证糖萼层在衰老和神经退行性疾病中的变化。他们使用透射电子显微镜 （TEM） 结合硝酸镧染色观察幼龄 （3月龄） 和老龄 （21月龄） 小鼠的大脑内皮糖萼层，发现老年小鼠的糖萼层显著变薄（图2）。

图2. 幼龄和老龄小鼠皮质毛细血管的透射电镜硝酸镧染色

针对这些幼龄 （3月龄） 和老龄 （21月龄） 小鼠进行了RNA测序分析，研究人员比较了幼龄和老龄小鼠的大脑内皮细胞基因表达，发现糖基化相关基因的表达发生了显著变化，特别是黏蛋白型O-糖基化途径的下调。此外，他们还使用流式细胞术和荧光成像技术直接分析了大脑内皮细胞的糖基化情况，发现透明质酸、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的表达增加，而糖萼型糖蛋白的表达减少（图3）。最后，他们通过蛋白质组学分析富集了脑内皮细胞腔内的蛋白质，发现老年小鼠的脑微血管中粘蛋白型O-糖基化合成酶C1GALT1和B3GNT3的水平显著降低，这与转录组数据一致。

图3. 脑内皮糖萼在衰老过程中高度失调

粘蛋白型O-糖基化是一种翻译后修饰，通过在蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上附加α-N-乙酰半乳糖胺 （α-GalNAc） 来启动。这种修饰形成的粘蛋白域具有独特的生物物理和生化特性，并广泛参与调节膜形态、信号传导和细胞间相互作用。研究人员，使用StcE （一种细菌粘蛋白酶） 的特异性染色试剂标记发现，幼龄小鼠的脑内皮细胞中有强烈的粘蛋白域糖蛋白染色，而老年小鼠则显示出较弱的、更异质性的染色（图4）。研究人员通过静脉注射活性StcE，发现可以导致脑内皮细胞糖萼层的显著降解，表明粘蛋白结构域糖蛋白是脑内皮细胞糖萼层的关键结构成分，并表明它们的失调可能导致随着衰老观察到的糖萼层的结构损伤。

图4. 衰老和神经退行性疾病中粘蛋白型O-糖基化在脑内皮细胞中下调

考虑到许多与 BBB 功能障碍相关的相同分子变化发生在不同的 CNS 疾病状态中，研究人员试图确定的衰老数据集中看到的类似的脑内皮糖萼失调途径是否可以在不同的神经退行性疾病中观察到。研究人员对先前发表的阿尔茨海默病和亨廷顿病单核 RNA-seq （snRNA-seq） 数据集进行了差异糖基化相关基因分析，发现脑内皮粘蛋白型O-糖生物合成是在这两种疾病数据集中富集的共同下调通路。在 19 个共享的下调基因中，其中 8 个是粘蛋白型 O-糖生物合成酶。随后，研究人员通过对阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照组的急性分离脑血管进行染色，确认了C1GALT1和黏蛋白域糖蛋白水平的降低。这些数据表明， 黏蛋白型O-糖基化的下调可能是多种神经退行性疾病中普遍存在的血脑屏障功能障碍的保守糖基化特征之一 。

为了进一步测试靶向破坏管腔粘蛋白型 O-糖基化的效果，研究团队使用静脉注射 StcE 在体内切割管腔粘蛋白结构域糖蛋白。发现在幼龄小鼠中接受 StcE 处理 24 小时导致 StcE （E447D） -AF647 标记显著降低，BBB 通透性增加此外，持续两天的 StcE 治疗导致更广泛的 BBB 功能障碍和意外的脑出血，伴有脑膜和脑室中明显的红细胞渗漏(图5)。

图5.脑内皮黏液型O-糖基化减少增加血脑屏障渗漏和脑出血

最后，研究人员测试了是否可以通过在脑内皮细胞中过表达两种年龄下调的粘蛋白型 O-糖生物合成酶 C1GALT1 和 B3GNT3 来逆转老年小鼠中下调的脑内皮粘蛋白型 O-糖基化的有害影响。研究人员通过构建了携带C1GALT1和B3GNT3基因的AAV载体，并将其注射到老年小鼠体内。这些载体在脑内皮细胞中特异性表达C1GALT1和B3GNT3，从而增加了糖萼层的核心1型O-糖基化（图6）。实验结果表明，这些干预措施显著恢复了老年小鼠的糖萼层，减少了神经炎症标志物，改善了认知功能。具体表现为老年小鼠的空间工作记忆和行为恐惧条件反射测试表现显著提高，表明其认知功能得到了改善。

图6. 粘蛋白型 O-糖基化的恢复改善了老年小鼠的 BBB 功能

总结来说，本文采用了一系列手段，从电子显微镜直接观察糖萼的结构变化，随后进行基因表达分析，流式细胞术，质谱分析糖蛋白组，以及最终的小鼠行为测试，全面地证明了糖萼在BBB中的结构作用与黏蛋白型O-糖基化的重要性，以及这些发现对治疗年龄相关神经退行性疾病的潜在意义，为治疗相关疾病提供了新的思路。

供稿 | 李佳晨

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲