自闭症谱系障碍属于神经发育障碍（DSM-V）【1】，目前我国发生率已经超过1%；智力障碍与发育迟缓在人群中的发病率在1-3%【2】。长期以来，这类以社交异常、智力障碍、发育迟缓为主要症状的神经发育障碍疾病的发生机制并不清晰。针对神经发育研究难点，中国科学院广州生物医药与健康研究院陈捷凯课题组经过多年积累，运用病人诱导多能干细胞（iPS）技术构建神经发育障碍研究模型，近日与合作者在Science Bulletin、Molecular Psychiatry等期刊发表论文，阐明基因KMT2D和SHANK2突变的致病机制。人类神经发育障碍疾病研究的难点在于人类神经系统与模式动物差别极大，具备更加复杂的细胞类型及神经环路结构；另一方面，发育是一个高度时空动态过程，疾病表型出现的时候已经距离调控异常点（疾病原点）很远，难以追溯。诱导多能干细胞（iPS）技术可以在细胞水平实现“返老还童”，从诞生之日就被寄于厚望用来模拟人类发育疾病，但由于iPS细胞的质量控制和基因编辑存在困难，这一科研范式在实际应用中的效果并不理想。陈捷凯课题组与多团队紧密合作，运用多年以来在iPS细胞相关技术和表观遗传调控机制的积累，结合类器官等定向分化手段和单细胞多组学建立“疾病细胞谱系”研究平台，追溯疾病起始机制，有效地攻克了相关问题。KMT2D作为KABUKI综合征（歌舞伎综合征）的致病基因以及KMT2C/D COMPASS复合物的核心酶因子，负责组蛋白H3K4me1甲基修饰。KMT2D突变患者除了智力低下，还具有特殊面容、室间隔缺损等神经嵴异常相关症状。2024年9月7日，陈捷凯课题组与中山大学附属第三医院邹小兵课题组在Science Bulletin上发表了研究论文KMT2D deficiency leads to cellular developmental disorders and enhancer dysregulation in neural-crest-containing brain organoids，阐明了KMT2D失活致病的发育分子机制。KMT2D-KABUKI综合征研究的难点有如下几点：1）其症状提示多个细胞谱系受累，包括神经元、神经嵴等，但过去的研究缺乏在多个谱系生成过程中鉴定KMT2D的表观调控功能；2）KMT2D作为H3K4me1的催化酶，同家族蛋白KMT2C可有效互补其大部分功能，干细胞与神经发育中特异由KMT2D激活的位点极少【3, 4】；3）H3K4me1是一个增强子调控修饰，研究证明KMT2C/2D对于增强子从沉默到活化是极为重要的【5, 6】，但增强子具有高度时空特异性，不同细胞、不同发育阶段变化极大，难以追踪到其起始致病细胞和致病增强子。陈捷凯课题组与中山大学附属第三医院邹小兵课题组合作，利用人胚胎干细胞以及KABUKI综合征患者家系iPS细胞，建立含神经嵴的类脑器官分化模型，并在该模型中发现稳定地与KMT2D失活关联的细胞表型：神经嵴分化缺陷、神经细胞过早分化且异常倾向抑制性神经元方向。为了揭示其背后的表观遗传调控机制、鉴定KMT2D所靶标的细胞类型特异增强子，研究者们开发了基于单细胞多组学整合分析的生物信息分析方法-“genome-wide cis-regulatory element explorer (GREE) ”，从高噪音且稀疏的scATAC-seq矩阵中识别细胞类型特异性的染色质开放区域和转录调控因子。GREE精准溯源KMT2D失活导致的疾病细胞谱系初始致病细胞——Roof plate样微环境细胞、及其核心增强子——WNT3A增强子（图1）。图1：GREE识别出KMT2D调控Roof plate样细胞中特异开放的WNT3A增强子通过严格的对照与重复（包括病人iPS、家系对照、正常胚胎干细胞敲除及突变引入对照），结合多谱系类脑器官的时序采样，和单细胞分辨率的多组学动态分析，该论文发现KMT2D失活后，Roof plate样细胞无法正常激活WNT3A的核心增强子，微环境WNT信号活性不足，从而导致神经干细胞提前分化且异常倾向抑制性神经元谱系方向，同时导致神经嵴谱系分化障碍。这一清晰的从细胞到分子的机制解析，攻克了KMT2D-KABUKI综合征研究的难点，确立了iPS疾病模型和疾病细胞谱系研究范式的有效性。研究进一步通过删除WNT3A增强子的细胞模型、KMT2D点突变小鼠模型强化了机制证明，并通过发现的靶点使用WNT信号通路激动剂或WNT3A蛋白，在类器官水平上挽救了疾病表型。这些结果说明在细胞上的精确质量控制能有效支撑关键机制发现。图2：利用疾病类器官模型研究KMT2D功能缺失的致病机理自闭症谱系障碍由多基因多因素诱发，陈捷凯课题组除了阐明KMT2D失活的致病机制，还和暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院师玲玲团队合作，同样使用病人iPS疾病造模方法揭示了临床发现的自闭症易感基因SHANK2的新发致病突变SHANK2BY29X的致病神经机制，该部分工作于2024年5月4日在Molecular Psychiatry杂志发表，题为Autism patient-derived SHANK2BY29X mutation affects the development of ALDH1A1 negative dopamine neuron。SHANK2具有多个剪切体，临床发现的SHANK2BY29X仅影响其中SHANK2B剪切体，之前该剪切体缺乏研究。研究运用单细胞分辨率的剪切体特异表达分析，发现SHANK2B特异性表达在ALDH1A1阴性的多巴胺神经元。通过严格对照设计的iPS细胞定向分化研究，确定该突变特异性影响ALDH1A1阴性多巴胺神经元早期发育，且能在突变小鼠模型中引发自闭相关症状。由于SHANK2已知大部分致病突变均影响SHANK2B剪切体，这一机制极有可能在SHANK2突变导致的自闭症机制中扮演重要作用。经过多年潜心研究和技术积累，陈捷凯课题组及合作课题组不仅克服了iPS细胞质量控制和基因编辑的难题，还成功地将iPS技术与类器官等分化模型相结合，构建出能够模拟人类神经发育过程并表征疾病发生机制的研究模型。目前，陈捷凯和邹小兵合作团队已经构建了100+个家系的神经发育疾病资源库，包括25个家系的iPS细胞库。这一创新性的疾病细胞谱系研究平台精准溯源“病根”，为深入解析神经发育障碍疾病的致病机制提供了强有力的工具。白居易在《病气》中感慨到“若问病根深与浅，此身应与病齐生”，该平台建立了细胞与病“齐生”的动态发生范式，可以深入解析神经发育疾病机理，让“此身莫与病齐生”。
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1. 具有或将要取得博士学位，
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制版人：十一
1 First, M. B. Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 5th edition, and clinical utility. J Nerv Ment Dis 201, 727-729, doi:10.1097/NMD.0b013e3182a2168a (2013).2 Moeschler, J. B., Shevell, M. & Committee on, G. Comprehensive evaluation of the child with intellectual disability or global developmental delays. Pediatrics 134, e903-918, doi:10.1542/peds.2014-1839 (2014).3 Hu, D. et al. The MLL3/MLL4 branches of the COMPASS family function as major histone H3K4 monomethylases at enhancers. Mol Cell Biol 33, 4745-4754, doi:10.1128/MCB.01181-13 (2013).4 Xie, G. et al. MLL3/MLL4 methyltransferase activities control early embryonic development and embryonic stem cell differentiation in a lineage-selective manner. Nat Genet 55, 693-705, doi:10.1038/s41588-023-01356-4 (2023).5 Kubo, N. et al. H3K4me1 facilitates promoter-enhancer interactions and gene activation during embryonic stem cell differentiation. Mol Cell 84, 1742-1752 e1745, doi:10.1016/j.molcel.2024.02.030 (2024).6 Lee, J. E. et al. H3K4 mono- and di-methyltransferase MLL4 is required for enhancer activation during cell differentiation. eLife 2, e01503, doi:10.7554/eLife.01503 (2013).
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