Plus深读 | DNA甲基转移酶调控胃癌中的EMT相关的转移

背景介绍

DNA甲基化是基因组表观遗传修饰的重要组成部分，在调节细胞增殖、分化、个体发育等方面起重要作用。DNA甲基化水平的异常与肿瘤的发生发展密切相关。

基因组甲基化模式的建立和维持由DNA甲基转移酶负责完成。其中DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）是从头甲基化的两种甲基转移酶之一，通过控制基因启动子区的甲基化状态调节该基因的表达水平。DNMT3A可以与细胞内的转录因子、组蛋白甲基转移酶以及microRNA作用，协同完成对肿瘤相关基因的调控，是近年来肿瘤表观遗传机制研究的重要分子。

已有的研究发现DNMT3A基因突变可见于多种血液系统肿瘤，尤其在急性髓系白血病中发生频率较高，并提示不良预后。在实体瘤中，虽然DNMT3A已经被发现存在表达异常，但其临床意义及具体的功能机制尚不完全清楚，有待进一步的研究。

现有的报道DNMT3A含有至少两个异构体，DNMT3Aa（全长蛋白，由基因DNMT3Aa编码）以及DNMT3Ab（较短的异构体，由位于DNMT3Aa第六个内含子内的启动子调控转录）。其中DNMT3Ab是胚胎干细胞、胚胎性癌细胞中主要表达的异构体。

文章概括

在这篇文章中，研究人员报道了DNA甲基转移酶DNMT3A的异构体 DNMT3Ab ，对于胃癌中上皮间充质细胞转换（EMT）过程及肿瘤转移非常重要。

在这篇文章中，研究者通过对胃癌样本的分析、以及体内外的功能学研究，证明了DNMT3Ab可以促进胃癌细胞的迁移以及侵袭能力，对胃癌的转移非常重要。进一步的机制研究发现DNMT3Ab被招募到E-cadherin的启动子区调控该区域的DNA甲基化，并与H3K9me2和H3K27me3修饰协同作用，抑制E-cadherin的转录，从而影响胃癌细胞的转移能力，并且这一过程依赖于转录因子Snail。研究者的发现加深了对DNMT3A及其异构体在胃癌转移过程中作用的了解，从表观遗传调控的角度为胃癌的治疗提供了新的潜在靶点。

DNMT3Ab调控胃癌EMT过程模式图

研究结果

1. DNMT3Ab在胃癌中过表达并具有临床重要性

研究者首先运用免疫印迹法检测了胃癌样本中DNMT3Aa和DNMT3Ab的表达量，发现与癌旁组织相比， DNMT3Aa和DNMT3Ab在肿瘤组织中显著过量表达（图1a-1c），并且DNMT3Aa与DNMT3Ab的表达无相关性（图1d），提示DNMT3Aa、DNMT3Ab在胃癌中可能具有不同的生物学功能。

进一步的临床病理相关性分析发现DNMT3Ab的过量表达与TNM分期、阳性淋巴结数目增多相关；而DNMT3Aa过表达则与肿瘤细胞分化和血管侵袭相关（表1）。在原位肿瘤组织中，淋巴结转移伴随DNMT3Ab高表达，而DNMT3Aa表达量与淋巴结转移没有相关性（图1e，1f），提示DNMT3Ab可能对胃癌患者的转移具有重要性。

此外，研究者对130例胃癌样本进行IHC染色，发现DNMT3Aa主要位于细胞核，而DNMT3Ab在全细胞弥散表达（图1g）。且DNMT3Ab表达量越高，预后越不良，是影响患者生存率的独立风险因子（图1h）。

图1. 胃癌组织中DNMT3Ab过量表达

表1. DNMT3Ab表达量与胃癌肿瘤组织的临床病理相关性分析

2. DNMT3Ab促进胃癌细胞的转移

在细胞层面，研究者发现与胃黏膜上皮细胞系GES-1相比，DNMT3Ab在胃癌细胞中表达量上调。研究者在转移能力较弱的MKN45、BGC-823胃癌细胞株中构建了DNMT3Ab的稳定过表达株，在转移能力较强的MKN28细胞株中构建了DNMT3Ab稳定敲低细胞株，进而在体内、体外检测DNMT3Ab对胃癌细胞转移能力的影响。

体外实验发现过表达DNMT3Ab显著增强了胃癌细胞的迁移和侵袭能力，而不影响细胞增殖（图2a, 2b）；与之相反，敲低DNMT3Ab则导致细胞的迁移、侵袭能力显著减弱（图2c）。

体内肿瘤转移实验发现，与对照组相比，尾静脉注射过表达DNMT3Ab胃癌细胞的裸鼠胃癌肺转移增加，转移淋巴结数目也增加（图2d, 2e）。通过IHC染色，发现肺部转移病灶中DNMT3Ab表达量上升（图2f）。

图2. DNMT3Ab增强胃癌细胞体外运动能力及体内转移能力

3. DNMT3Ab过表达引起上皮间充质转换EMT

研究者观察到过表达DNMT3Ab的胃癌细胞形态发生改变，从单层上皮样细胞变为梭形的纤维细胞样形态，提示细胞可能发生了EMT过程；而过表达DNMT3Aa则不引起细胞形态变化（图3a）。与表型一致，在分子层面，免疫印迹实验发现过表达DNMT3Ab的细胞中上皮标志物E-cadherin、β-catenin表达量降低，间充质标志物Vimentin、N-cadherin表达量上升；而DNMT3Aa则不改变标志物的表达量（图3b）。免疫荧光实验发现过表达DNMT3Ab导致E-cadherin表达量降低，Vimentin表达量升高，同时F-catin染色结果提示细胞内肌动蛋白细胞骨架发生重排（图3c）。这些结果提示DNMT3Ab可能是通过引起EMT促进了胃癌细胞的侵袭能力。

图3. DNMT3Ab引起EMT过程

4. DNMT3Ab调控E-cadherin启动子区DNA甲基化，抑制E-cadherin转录

EMT的标志之一是E-cadherin的功能丢失，而之前的研究报道DNA甲基化对E-cadherin的抑制与胃癌细胞的转移能力相关。

通过定量甲基化特异性PCR（Q-MSP）检测，研究者发现过表达DNMT3Ab引起E-cadherin启动子区甲基化水平上升；而敲低DNMT3Ab引起甲基化水平下降（图4a-4c）。焦磷酸测序技术也发现过表达DNMT3Ab后E-cadherin启动子区DNA甲基化发生频率显著上升（图4d）。同时，ChIP实验表明过表达DNMT3Ab时E-cadherin启动子区域的DNMT3Ab结合增加（图4e）。

同时研究者发现DNMT3Ab过表达细胞中E-cadherin表达量下降，DNMT3Ab敲低细胞中E-cadherin表达量增加（图4f, 4g）；而过表达或敲低DNMT3Aa则不能影响细胞中E-cadherin的表达水平（图4h）。

此外，研究者比较了24例胃癌样本，发现DNMT3Ab与E-cadherin的表达呈负相关，而DNMT3Aa与E-cadherin的表达之间则没有相关性（图4i）。

图4. DNMT3Ab抑制E-cadherin表达

5. 抑制DNMT3Ab削弱了胃癌细胞的EMT及转移

DNMT3Ab抑制E-cadherin的表达，那么DNMT3Ab是否在胃癌细胞的EMT过程中发挥作用呢？研究者首先用TGF-β处理胃癌细胞，获得了间充质表型、及与之相符的分子marker变化，同时观察到DNMT3Ab、及EMT相关因子Snail的表达水平上调（图5a, 5b）；并且这种由TGF-β所引起的EMT过程在siRNA抑制DNMT3Ab表达后被抑制（图5c），伴随E-cadherin启动子区DNA甲基化修饰的减少及E-cadherin表达量的上调（图5d, 5e）。进一步的ChIP实验发现，在经TGF-β处理的胃癌细胞中抑制DNMT3Ab表达后，E-cadherin启动子区域DNMT3Ab、H3K9me2、H3K27me3的富集降低（图5f）。

此外，体内肿瘤转移实验发现，与对照组相比，尾静脉注射DNMT3Ab敲低胃癌细胞的裸鼠发生转移的概率降低（图5g）。

图5. DNMT3Ab的沉默抑制了EMT过程及胃癌细胞的转移

6. DNMT3Ab对E-cadherin的调控依赖于Snail

为了研究DNMT3Ab与Snail在调控E-cadherin中的关系，研究者进行了免疫沉淀实验，发现DNMT3Ab与Snail直接相互作用，而DNMT3Aa则不能（图6a），并且在DNMT3Ab过表达细胞中，Snail在E-cadherin启动子区域的结合增加。

在DNMT3Ab过表达细胞中用siRNA抑制Snail表达，导致E-cadherin表达量上调，E-cadherin启动子区域DNA甲基化下降，并且E-cadherin启动子区域DNMT3Ab、H3K9me2、H3K27me3的富集显著减少（图6b-6d）。同时，表型实验发现胃癌细胞在DNMT3Ab过表达后增强的的转移和侵袭能力在抑制Snail后显著减弱（图6e, 6f）。

图6. DNMT3Ab对E-cadherin的抑制依赖于Snail

7. DNMT3Ab改变了转移相关基因的表达谱

为了研究DNMT3Ab如何特异性调控胃癌细胞的转移及EMT过程，研究者分析了对照细胞及DNMT3Ab过表达细胞的基因表达谱，并与前期实验中DNMT3Aa过表达细胞及对照细胞的基因表达谱进行比较，找到了317个表达受到DNMT3Ab特异性调控的基因（图7a）。通过GO分析，发现过表达DNMT3Ab主要影响细胞运动和TGF-β信号通路（图7b, 7c）；这其中一系列与肿瘤细胞侵袭、EMT过程相关的基因如CLDN7、MMP7、FN1等表达发生改变，qPCR进一步验证了这些变化（图7d, 7e），提示DNMT3Ab通过调控多个转移相关基因的表达，对胃癌细胞转移、侵袭的能力进行调控。

图7. DNMT3Ab调控转移相关基因的表达水平

讨论

DNA异常甲基化与肿瘤的发生发展、细胞癌变有着密切的联系。胃癌是最为常见的恶性肿瘤之一，且容易发生转移，预后不良。而DNMT家族蛋白在胃癌中的作用还不十分清楚。这篇文章中，研究者从临床样本出发，发现了DNMT3Ab在胃癌组织中的过量表达，并通过进一步的体内外的功能学实验，阐明了DNMT3Ab在胃癌转移过程中的重要调控作用，及其调控机制。研究者的工作为表观遗传修饰如何精细调控胃癌的转移提供了更多的证据， DNMT3Ab/Snail/E-cadherin信号轴可能为伴随DNMT3Ab高表达的转移性胃癌提供了新的治疗策略。

原文链接：

http://pmo347760.pic31.websiteonline.cn/upload/s41388-018-0285-1.pdf

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