热性中药附子调节机体内源性代谢产物的分子作用机制研究

附子为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaeli Debx 的侧根，性热、味辛，首载于《神农本草经》，具有回阳、逐冷、祛风湿等作用，是临床常用中药，主要用于大汗亡阳、四肢厥逆、霍乱转筋、肾阳衰弱的腰膝冷痛、形寒爱冷、精神不振以及风寒湿痛、脚气等病症的治疗。近年的现代研究发现其对心血管疾病的治疗作用显著、疗效 明确，但其确切的分子作用机制目前尚未得以揭示 ^[1-2] 。 代谢组学是从整体上对生物机体内代谢物 的动态变化进行分析研究的现代生物学分析技术 ^[3] ， 与中药多组分、多靶点、多效应的作用特点和整合作用的治疗特征不谋而合，是研究中药对机体产生变化的重要现代化手段。本实验在以往对辛热中药药性、药效评价的基础上，利用 UPLC-MS/MS 组学技术分析典型的热性中药附子干预小鼠后的内源性血清代谢物变化，寻找可能表征附子性效相关的代谢途径及相关靶点，进而阐释其治疗心血管疾病可能的分子机制。

1 材料

1.1 药材

附子饮片购买于北京同仁堂，经中国中医科学院中药研究所生药室鉴定为毛莨科植物乌头 Aconitum carmichaelii Debx. 子根的加工品，符合《中国药典》 2015 年版的相关规定。

1.2 仪器与试剂

DIONEX Ultimate 3000 超高效液相色谱仪（ Themo Fisher 公司）； Thermo Q EXACTIVE 质谱仪（ Themo Fisher 公司）； C ₁₈ 色谱柱（ 100 mm × 2.1 mm ， 1.7 μm ， Thermo Syncronis 公司）； BSA223S 型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）； Milli-QAdvantageA10 型超纯水仪（ Millipore 公司）；电子天平（ MettlerToledo 公司）； DW-HL388 型 −80 ℃超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）； BCD-320D11D 型冰箱（信科龙电器股份有限公司）； 5402 型冷冻离心机（ Eppendorf 公司）； KQ-250 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇（色谱级，批号 152469 ）、乙腈（色谱级，批号 136376 ）、甲酸（色谱级，批号 152469 ）、甲酸铵（色谱级，批号 152469 ）均购于 Themo Fisher 公司；超纯水（屈臣氏集团）。

1.3 实验动物

雄性昆明小鼠 20 只，体质量为 18 ～ 22 g ，购买 于军事医学科学院。动物许可证号为 SCXK- （军） 2012-0004 。实验小鼠适应性饲养 7 d 后进行正式实验。

1.4 数据库及软件

Metlin ^[4] 数据库（ http://metlin.scripps.edu/ ）； HMDB ^[5] 数据库（ https://www.hmdb.ca ）； KEGG ^[6-7] 数据库（ https://www.genome.jp/kegg/ligand.html ）； Mzcloud 数据库（ https://www.mzcloud.org/ ）； MetaboAnalyst 4.0 ^[8] 数据库（ https://www. metaboanalyst.ca/ ）； Cytoscape v 3.7.0 ^[9] 软件（ https://www.cytoscape.org/ ）； MetScape ^[10] 插件（ http://apps.cytoscape.org/apps/metscape ）； Trace Finder 软件。

2 方法

2.1 中药制备

将小鼠用药剂量按照公式进行折算，然后用电子天平称取一定量的附子饮片后倒入烧杯中，加蒸馏水浸泡（用量为浓缩后药液的 10 倍量体积），时间为 30 min 。然后倒入锅中，进行煎煮。一煎：先用武火煮至锅中水沸腾，再用文火煎煮 1.5h 后，使用纱布滤过；二煎方法与一煎相同，煮沸后，文火煎煮 0.5 h ，合并 2 次煎液，再用文火浓缩至质量浓度为 0.15 g/mL 。附子为有毒中药，煎煮过程中加入适量开水，以保证其药效及减小毒副作用。

小鼠用药剂量＝ 9.01 ×成人用药剂量

2.2 动物分组及给药

将 20 只雄性小鼠进行随机分为 2 组，每组 10 只，分别为附子组和对照组，每组进行编号。连续 ig 给药 4 d ，小鼠给药量为 15 mL/(kg∙d) ，对照组 ig 蒸馏水 15 mL/(kg∙d) 。

2.3 血样采集与处理

小鼠给药结束后，进行眼球取血，采集其血样于 1.5 mL EP 管中。将采集到的血样 4 ℃冰箱静置 2 h ，然后在 4 ℃条件下，以 12 000 r/min 的速度离心 10 min ，离心后的血清在 −80 ℃条件下冷冻保存。分析前，将冷冻的小鼠血清取出，室温解冻，从每 个血清样品中取 50 μL ，加入沉淀剂甲醇 - 乙腈（ 1 ∶ 1 ） 450 μL ，涡旋 30s ，然后在 4 ℃条件下，以 12000 r/min 的速度离心 10 min ，取其上清液，直接进样分析。

2.4 UPLC-MS / MS 分析

2.4.1 色谱条件 色谱柱为 ThermoSyncronis C ₁₈ 色谱柱（ 100 mm × 2.1 mm ， 1.7 μm ），流动相组成为水（含 0.1% 甲酸及 2 mmoL/L 甲酸铵， A ） - 乙腈（ B ）。梯度洗脱，洗脱时间为 0 ～ 35 min ，进样量为 5 μL ，体积流量为 0.3 mL/min 。流动相梯度洗脱条件为： 0 ～ 1.00 min ， 95%A ； 1.00 ～ 25.00min ， 95% ～ 5%A ； 25.00 ～ 30.00 min ， 5%A ； 30.00 ～ 30.01 min ， 5% ～ 95% A ； 30.01~35.00 min ， 95% A 。

2.4.2 质谱条件 采用 ESI 离子源正、负离子同时扫描模式；电喷雾电压为 2 800 V ；鞘气体积流量为 10.5 L/min ；辅助气体积流量为 3 L/min ；毛细管温度为 320 ℃；一级全扫描分辨率为 70 k ，扫描范围 m / z :50 ～ 1 000 ；二级数据依赖性扫描分辨率为 17.5 k ； Stepped NCE 值分别为 20 、 40 、 60 V 。

2.5 数据分析

将上述所得的小鼠血清内源性代谢物的分子式和相对分子质量在 Mzcloud 数据库中进行鉴定，同时利用 Trace Finder 自行建立代谢物数据库进行识别。再利用 Metlin 、 HMDB 、 KEGG 等数据库进行检 索并多次确认。在 MetaboAnalyst 4.0 中利用多种分析方法（ PCA 、 PLS-DA 及高通量代谢通路分析）进行分析。最后在 Cytoscape v 3.7.0 中利用 MetScape 绘制代谢网络图进行模块化分析和靶点筛选。

3 结果

3.1 一般情况

在整个实验过程中，对照组小鼠状态、饮食、大小便及行为活动等均无明显变化。小鼠 ig 附子水煎液后，整体状态良好，毛发正常，和对照组相比，并无显著性变化。随着给药时间的延长，附子组小鼠水摄入量增加，大便质地变硬，尿液颜色发生变化，活动量增加。各组小鼠状态持续至给药结束。

3.2 代谢物鉴别方式

在 Mzcloud 数据库中对小鼠血清内源性代谢物的分子式和相对分子质量进行鉴定识别，再利用多个数据库进行峰比对并多次确认。在正、负离子任意模式下，对应出峰时间，根据相应的离子碎片鉴别代谢物。如图 1 所示，以正离子模式下的缬氨酸为例确定内源性物质。图 1-A 中分别为正、负离子模式图，图 1-B 是正离子模式下缬氨酸的色谱峰，图 1-C 是正离子模式下缬氨酸所对应的离子碎片。

3.3 2 组小鼠血清比较分析

3.3.1 血清 UPLC-MS/MS 数据模式识别 附子组与对照组小鼠血清样品分别进行 PCA 、 PLS-DA 分析方法对比分析，选择 Pareto 模式为其数据处理方 法。如图 2 所示，对照组（ K ）用绿色表示，附子组（ A ）用红色表示。

首先将对照组与附子组进行 PCA 分析，如图 2-A 、 2-B 所示，可以看出，对照组和附子组样本分别有一定的聚集成群的趋势，并且 2 组样本能够较好地分离开来，说明在附子的干预下，小鼠体内代谢物发生了明显变化。利用 PLS-DA 分析方法对两组血清数据进行模式识别，如图 2-C 、 2-D 所示，可见对照组和附子组在有监督的情况下聚集性更强，而且 2 组样本更能有效分离。 3.3.2 差异代谢物筛选 经过“ 3.3.1 ”项中数据模式识别分析方法分析，可列出 20 （样本）× 184 （变量）的矩阵。采用 PLS-DA 分析，得到 5 种算法计算后的小鼠血清代谢物的变异权重系数（ VIP ）值表，筛选出 5 种算法下均满足 VIP ＞ 1 的差异代谢物共有 21 个。将矩阵列为 20 （样本）× 21 （变量），再进行 t 检验手动积分进一步筛选。最终，确定附子组与对照组对比后 18 个变量可作为差异代谢物。结果见表 1 、 2 。

3.4 代谢通路分析

对以上分析方法筛选出的差异代谢物进行高通量代谢通路分析，结果如表 3 、图 3 所示，同一代谢通路中的全部代谢物数量用 Total 表示；差异代谢物在同一代谢通路中出现的个数用 Hits 表示；在通路分析中计算的原始 P 值用 Rawp 表示。 Impact 值大于 0.10 的代谢通路表示该通路可能与潜在的靶标路径紧密相关。根据分析结果，共得出 5 条相关通路，分别为亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、烟酸和烟酰胺代谢、磷酸肌醇代谢通 路。

3.5 代谢组学网络构建及分析

在 Cytoscape v 3.7.0 软件中利用 MetScape 插件构建附子组与对照组比较得到的差异代谢物的相关 代谢网络（图 4 ）。在构建得到的代谢组学网络图中，总共可细分为 14 个相关网络模块，其中花生四烯酸代谢通路和亚油酸代谢通路是整个网络中最大的模块。在该网络图中，深色六边形表示代谢通路中本研究得到的差异代谢物，浅色六边形表示此通路中的其他代谢物，圆形代表相关靶点，边代表它们之前的相互关系。对此代谢组学网络进行拓扑分析，参数如表 4 所示。根据其拓扑参数可知该网络中每个基因或代谢物的直接邻居数均值为 8.010 ，表明每个基因或代谢物的节点度均值为 8.010 。在整个网络中，差异代谢物节点度值大于均值的有 4 个，分别为花生四烯酸（ 59 ）、亚油酸（ 55 ）、烟酰胺（ 26 ）和棕榈酸（ 11 ）。节点度值越大，表明其对整个网络的影响越大 ^[11] 。以上 4 个差异代谢物在所构建的代谢通路中分别作用于花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、饱和脂肪酸 β- 氧化通路，且这 4 个通路模块在网络中占比也最大。其中花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢通路和“ 3.4 ”项中构建的代谢通路分析结果一致。