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最新Nature Nanotechnology：给细胞器装个电压表

研之成理 · 公众号 · · 2020-11-07 08:00

正文

▲第一作者：Anand Saminathan

通讯作者：Yamuna Krishnan

通讯单位：美国芝加哥大学

DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-020-00784-1

背景介绍

由于缺乏合适的工具，膜电位在大多数细胞内细胞器的作用仍未被探索。

本文亮点

● 在此，作者介绍了 Voltair，一种荧光DNA纳米器件，它可以报告绝对膜电位，并且可以靶向活细胞中的细胞器。

● Voltair包括一个电压敏感荧光团和一个用于比率测定的参考荧光团，并作为内吞示踪剂。利用Voltair，作者可以在活细胞中原位测量不同细胞器的膜电位。

● Voltair可以潜在地指导生物相容电子学的合理设计，并增强我们对膜电位如何调节细胞器生物学的理解。

图文解析

伏特静息膜电位的设计和表征

通过两个电极之间的电势差来测量的:一个插入生物膜的样品电极和一个位于膜外的参考电极。伏尔泰使用了类似的概念，将插入生物膜的报告探针的荧光与位于生物膜外不同波长的参考探针的荧光进行比较。

▲图1 电压探针的设计与表征。

a，伏特计工作原理示意图:测量探针(G，绿色)是一种电压敏感染料(RVF)结合到一个DNA双链，该双链是通过附着在一个脂质锚(POPE)上膜拴着的。参比探针(R，红色)是一个DNA双链与参比染料(Atto647N，红色球体)一起与RVF报告膜电位比率。

b，RVF (RVF-N ₃ )和脂质锚定POPE的可接合版本的结构。

c，显示RVF与Atto647N荧光强度(G/R)像素比的伪彩色图像。

d, HEK 293T细胞中电压 ^PM ⁽ 灰色痕迹)和未修饰RVF(红色痕迹)作为质膜电位的传感器响应。插图:电压 ^PM ⁽ (黑色)和未修改RVF(红色)从0到100 mV的信号变化百分比(SC)。

e、f静息细胞(Res)细胞膜的绝对G/R值和夹住细胞电压在100mv和+ 100mv时的值。

靶向VoltairIM到特定内吞细胞器的膜

接下来，作者利用清道夫受体介导的内吞作用将Voltair ^IM 靶向到溶酶体内途径的细胞器上。基于DNA的探针可以标记表达清道夫受体的不同细胞类型中的特定内吞细胞器。由于HEK 293T细胞不表达清除剂受体26，我们通过瞬时转染在HEK 293T细胞中过表达融合到CFP的人巨噬细胞清除剂受体(hMSR1)。这导致了 Voltair ^IM 的有效内部化。hMSR1-CFP与 Voltair ^IM 的共定位和竞争实验表明， Voltair ^IM 的摄取是由清道夫受体介导的。

▲图2 将Voltair ^IM 靶向于特定的内吞细胞器膜。

a、靶向策略示意图： Voltair ^IM 通过结合清道夫受体进行清道夫受体介导的内吞作用。细胞内吞 Voltair ^IM 以时间依赖的方式从质膜到早期内质体、晚期内质体和溶酶体。

b、转染hek293t细胞的内化 Voltair ^IM （红通道）与人巨噬细胞清除剂受体（hmsr1cfp，绿色通道）之间的典型共定位。

c、在有无mBSA（30当量）的情况下，细胞内 Voltair ^IM 摄取的标准化强度，误差条表示n=30个细胞的三个独立试验的平均值±s.e.m。

d、不同内吞细胞器标记物（绿色通道）和 Voltair ^IM （红色通道）在指定的追逐时间内的代表性共定位。早期内切体用转铁蛋白alex546（Tf）标记，晚期内切体用rab7mrfp（Rab7）标记，溶酶体用TMR葡聚糖（右旋糖酐）标记。

e、Voltair共定位（CL）的Pearson相关系数（PCC）与d中相应的内吞标记物以及像素位移（PS）。

原位测量绝对溶酶体膜电位

首先，作者验证了 Voltair ^IM 在溶酶体中的作用，从电生理学给出了广泛的经验知识。将hk293t细胞中 Voltair ^IM 标记溶酶体的G和R通道中的荧光图像转换为G/R图像，从中可以获得G/R分布。考虑到腔为阳性，胞质面为阴性，溶酶体膜电位为+114mv。这与不同细胞类型的电生理学一致。

▲图 3 Voltair ^IM 测量溶酶体膜电位。

a、用 Voltair ^IM 标记的放大溶酶体的电压钳位示意图。

b、假彩色图像显示在溶酶体内部小叶上标记的 Voltair ^IM 的像素G/R比，作为整个溶酶体电压钳位施加的膜电位的函数。

c、 Voltair ^IM 灰色迹线，正方形）和 Voltair ^IM

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