基于网络药理学和分子对接探寻升降散抗新型冠状病毒潜在作用机制研究

摘 要：目的  探究升降散抑制新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的潜在作用。方法  采用ETCM、中药系统药理学分析平台（TCMSP）、BATMAN-TCM和CMAUP数据库获得到升降散复方的靶蛋白基因；采用GeneCards数据库获取抗病毒相关靶基因；采用交集法进而获得升降散复方与抗病毒作用相关的靶基因；运用Cytoscape 3.7.2构建“复方-中药-靶点”网络；运用R语言进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，预测升降散抗病毒的潜在作用。采用TCMSP、中国知网和PubChem数据库检索升降散中的化学成分，将各化学成分与3CL水解酶和血管紧张素转换酶II（ACE2）进行分子对接。结果  升降散复方可能通过663个基因发挥抗病毒作用。KEGG富集筛选得到10条与抗病毒最相关的通路（P＜0.01），涉及甲型流感等通路。升降散中与3CL水解酶和ACE2进行分子对接的结合能数值小于−29.3 kJ/mol的化合物分别有133个和145个。结论 升降散可能通过多通路发挥抗病毒作用，对新型冠状病毒具有潜在的抑制作用。

新型冠状病毒肺炎，又名2019冠状病毒病（COVID-19）^[1]，为一种新型冠状病毒（SARS- CoV-2）感染引起的急性传染病。世界卫生组织宣布将COVID-19全球风险等级提至最高级别^[2]。该病毒感染的临床症状一般为发热、乏力、干咳或腹泻，逐渐出现呼吸困难等，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒在人群中易感染，潜伏期长。截至2020年2月28日24时，累计报告确诊病例79 251例^[3]。目前仍无治疗COVID-19的特效药物，因此亟待研究和开发出抗SARS-CoV-2的药物。升降散源于清代杨粟山所撰的《伤寒温病条辨》，为中医治疗温病名方，由大黄Rheum officinale Baill.、僵蚕Beauveria bassiana (Bals.) Vuillant、蝉蜕Cryptotympana pustulata Fabricius和姜黄Curcuma Longa L. 组成，擅治温病表里三焦大热，无论病情轻重皆可酌用。近年来，该方用于治疗了多种温热病，表现出良好的抗感染、退热等作用^[4]。

随着对COVID-19认识的不断深入，国家发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行）》（以下简称诊疗方案）在短短的1个月内已更新至第七版。各省市自治区也结合地域特点，先后出台了各自的诊疗方案，升降散已成为国家卫健委诊疗方案（第三版）推荐处方之一^[5-6]。作者团队也曾将升降散用于COVID-19患者的治疗，收到了良好效果。中药复方的物质基础为化合物群/库，从已有的抗病毒中成药或汤方中筛选潜在的抗SARS-CoV-2药物，可能是一条捷径。已有文献报道^[6]，在SARS-CoV-2冠状病毒进入人体细胞后，释放出的RNA直接与宿主的核糖体结合，翻译出的病毒复制所需的关键蛋白酶，已知3CL水解酶为关键蛋白酶之一。研究证实血管紧张素转换酶II（ACE2）受体蛋白对于SARS-CoV-2感染细胞是必需蛋白^[7]。目前SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2已为抗SARS- CoV-2药物开发的热点靶标。本研究拟对升降散组方药物大黄、僵蚕、蝉蜕和姜黄4味药物中的成分进行网络药理学和分子模拟对接研究，探索升降散组方药味中各化学成分抗SARS-CoV-2的可能作用，以期发现潜在的3CL水解酶/ACE2靶点药物。

1  材料

数据库包括中药系统药理学分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）^[8]，PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）^[9]，ETCM数据库（http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM）^[10]，BATMAN- TCM中药分子机制的生物信息学分析工具（http:// bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）^[11]，CMAUP数据库（http://bidd2.nus.edu.sg/CMAUP/）^[12]，GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）^[13]。软件包括AutoDock Tools 1.5.6、AutoDock Vina 1.1.2、PyMol、Chem3D 17.1、LigPlus、Cytoscape 3.7.2和R语言软件包。

2  方法

2.1  获取升降散中各味中药的相关靶点蛋白基因

以升降散中的4味中药的中文拼音/拉丁文名称为关键词，在ETCM、TCMSP、BATMAN-TCM和CMAUP等数据库检索，获得复方中各个中药相关的靶点蛋白基因。在数据库中未检索到相关中药的靶蛋白基因，则以该中药中的化合物为关键词进行检索获得相关靶蛋白基因。

2.2  获取抗病毒相关的靶点蛋白基因

通过GeneCards数据库，搜索关键词“antivirus”，获得了与抗病毒相关的靶蛋白基因。

2.3  构建“复方-中药-靶点”网络

通过Cytoscape 3.7.2软件构建“复方-中药-靶点”网络，并对“复方-中药-靶点”网络进行分析，得到该网络的分析参数。

2.4  靶点的通路分析

运用R语言富集分析clusterprofiler软件包对所得到的相关基因进行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析和GO（gene ontology）注释通路分析，并将其结果可视化。

2.5  升降散中化合物-靶蛋白分子对接

通过TCMSP、中国知网和PubChem数据库收集升降散组方中大黄、僵蚕、蝉蜕和姜黄各药味所含成分。从PubChem数据库中下载相应化合物结构式（SDF格式），用Chem3D软件转化为PDB格式备用。从PDB数据库（http://www.rcsb.org）下载SARS-CoV-2 3CL水解酶（PDBID：6LU7）和血管紧张素转化酶II（ACE2，PDBID：1R4L）的晶体结构，进行分子对接。采用AutoDock Tools 1.5.6软件删除SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2中水分子，分离配体和受体，添加非极性氢，计算Gasteiger电荷，分别保存为6LU7_sss.pdbqt和1R4L_sss. pdbqt文件。将待进行分子对接的化合物PDB格式文件导入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转。保存为pdbqt格式，作为对接配体。以SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2作为受体，以升降散组方中各化合物作为配体，根据靶蛋白中配体的坐标确定分子对接的活性位点，根据SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2活性口袋设置Gridbox坐标及大小。SARS- CoV-2 3CL水解酶的Gridbox位置设置为center_x＝−10.733，center_y＝12.416，center_z＝68.829；大小设置为size_x＝16，size_y＝22，size_z＝16；spacing＝1，其他参数默认。ACE2的Gridbox位置设置为center_x＝40.199，center_y＝6.024，center_z＝29.006；大小设置为size_x＝16，size_y＝16，size_z ＝16；spacing＝1，其他参数默认。采用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接。采用Pymol和Ligplus软件可视化分析对接构象。从各化合物对接结果的结合构象中，选取结合能较低且构象较好的对接结果。

3  结果与分析

3.1  升降散中各味中药的相关靶点蛋白基因

从ETCM、TCMSP、BATMAN-TCM和CMAUP等数据库中获得升降散中各味中药相关的靶点基因。去除重复靶点蛋白基因后，分别得到与大黄相关的靶点蛋白基因1 209个、姜黄相关基因804个、蝉蜕相关基因172个、僵蚕相关基因80个，它们之间的交集见图1。

3.2  升降散中各药物与抗病毒相关靶点蛋白基因

通过检索GeneCards数据库，获得与抗病毒相关的基因5 693个，将其与复方中1 597个相关基因进行交集，得到663个与抗病毒相关基因（图2）。据以上分析可知，升降散可能是通过这663个基因发挥抗病毒作用，其中大黄抗病毒靶基因有513个、姜黄有287个、蝉蜕有59个、僵蚕有80个（不同的中药之间存在重复靶点基因）。

3.3  构建“复方-中药-靶点”网络

通过Cytoscape 3.7.2软件构建“复方-中药-靶点”网络，并对“复方-中药-靶点”网络进行分析，得到以下网络分析参数：节点数目（number of nodes）为668个，网络度（networkdensity）为0.004，网络异质性（network heterogeneity）为8.183，网络中心度（network centralization）即平均相邻节点数（average number ofneighbors）为2.805，特征路径长度（characteristic path length）为2.587，最短路径（shortest paths）为452、256。

3.4  靶点蛋白基因的通路分析

对663个靶点蛋白基因进行KEGG通路富集分析，富集得到与抗病毒相关的前10条通路（图4），分别是人巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、乙型肝炎（hepatitis B）、人类T细胞白血病病毒I感染（human T-cell leukemia virus 1infection）、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（hepatitis C）、耶尔森氏鼠疫杆菌感染（Yersinia infection）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、人类免疫缺陷病毒1型感染（humanimmunodeficiency virus 1 infection）、病毒致癌（viral carcinogenesis）和甲型流感（influenza A）。其中升降散复方与甲型流感病毒通路的相关性最大，病毒感染后可将信号汇聚到IκB激酶（IKK）复合体引起核转录因子-κB（NF-κB）活化导致靶基因转录和表达在宿主免疫和炎症反应中起重要作用，且复制、致病也都依赖于蛋白激酶C（PKC）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）等通路的激活。

运用R语言富集分析clusterprofiler软件包对663个靶基因进行GO注释通路分析，得到GO条目3 977个（P＜0.01），其中生物过程（BP）条目3 500个，细胞组成（CC）条目186个，分子功能（MF）条目291个，分别占88%、5%、7%，见图5。通过“复方-中药-靶标”的关系网络分析和KEGG分析，发现升降散复方具有抗病毒的功效，但对SARS-CoV-2是否有抑制作用，具体复方中哪些成分可能起到抑制SARS-CoV-2的作用，这些问题网络药理学研究不能给出答案，故拟通过分子对接研究预测复方中哪些成分对新冠状病毒靶标具有潜在的抑制作用。

3.5  升降散中各化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子对接结果及分析

通过TCMSP、CNKI、PubChem检索到大黄、蝉蜕、姜黄和僵蚕中化合物297个，其中有117个化合物来源于大黄，有133个化合物来源于姜黄，有31个化合物来源于僵蚕，有16个化合物来源于蝉蜕。上述各化合物分别与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2靶标蛋白进行分子对接。升降散中部分化合物分子对接结果见表1、2。分子对接结合能越小，说明受体和配体之间的亲和力越大。一般认为结合能数值小于−29.3 kJ/mol说明受体和配体具有较好的亲和力。升降散中共有133个化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶进行分子对接的结合能数值小于−29.3 kJ/mol，其中大黄中的化合物有104个，姜黄中的化合物有6个，蝉蜕中的化合物有4个，僵蚕中的化合物有19个；共有145个化合物与ACE2进行分子对接的结合能数值小于−29.3 kJ/mol，其中大黄中的化合物有91个，姜黄中的化合物有27个，蝉蜕中的化合物有6个，僵蚕中的化合物有21个。说明升降散中的化合物群与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2有较好的结合活性，显示升降散发挥抗SARS-CoV-2的潜在作用及其特点。

3.6  升降散中各化合物与SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的结合模式分析

根据分子对接结果可知，大黄中蒽酮类化合物revandchinone-2对SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2都具有较高的亲和力，其结合能分别是−46.4、−53.1 kJ/mol，相互作用图见图6、7。SARS-CoV-2 3CL水解酶活性口袋区域主要位于蛋白晶体中原配体N3抑制剂所在的loop区域。通过进一步分析， revandchinone-2的羟基与3CL水解酶中的Phe140和Ser144形成氢键，与His41、Met49、Asn142、Gly143、Gln189形成疏水作用，增强了该化合物与靶蛋白之间的相互作力。同理，ACE2的活性口袋区域以其配体所在位置为分子对接的活性口袋区域。Revandchinone-2与Trp271、Cys344、Glu145、Asp269、Arg273、Thr371、Try515、His374等氨基酸形成疏水环，构成稳定的结合构象。

4  讨论

在几千年的历史长河中，中医药在抗击瘟病、疠疫方面发挥了重要作用，积累了丰富的经验。在2003年SARS来袭时，中医药的重要作用已经得到了彰显。在目前抗击COVID-19战役中，凡是中医药参与治疗的确诊患者，治愈率高、死亡率低^[14]。目前，国家和各省卫健委已经发布十10余种可用于新型冠状病毒肺炎COVID-19治疗的汤方剂或中成药，它们在抗疫过程中发挥了重要的作用。上述中药汤方或中成药多数已经被药学工作者迅速的进行了网络药理学或分子对接预测研究，并发现了多种可能的靶点药物。升降散是抗疫中卫生健康委员会发布的可使用抗疫中药方药之一，但目前还未见到相关研究报道。升降散是治疗温病宗方，适应证广泛，如憎寒壮热、头痛、骨节酸痛，或头面猝肿、咽喉肿痛、痰涎壅盛，或上吐下泻、呕吐血汁、丹毒发斑、雷鸣腹痛，或舌卷囊缩、腰痛如折、大便火泻、小便淋涩等。症状虽多，但受邪则一，均由“杂气内郁”所致，与COVID-19的临床多种症状类似。作者和其他在抗疫一线的中医专家，都曾给COVID-19患者对症使用过升降散，并收到了良好效果，故有必要对升降散治疗COVID-19的潜在作用进行预测探索研究。中药复方在抗病毒方面的优势，在于其不同于化学药的“锁钥”模式，中药复方的化学成分群，可以在遇到不同病毒的时候，启动不同的活性成分或活性成分群。化学药的研发速度远远慢于病毒的发现和变异速度，而对具有抗病毒作用的中药成药或方剂进行挖掘和探索，可能是研究抗新冠病毒药物的一条捷径。

本研究通过搜索GeneCards数据库，获得了与抗病毒相关的靶蛋白基因及升降散各药物相关的靶蛋白基因，交集后得到了升降散复方的663个与抗病毒相关的靶蛋白基因。这663个相关的靶蛋白基因中包括大黄的513个、姜黄的287个、蝉蜕的59个、僵蚕的80个抗病毒靶蛋白基因。通过KEGG富集分析得到了与抗病毒最相关的10条通路，分别是人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、人类T细胞白血病病毒I感染、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、丙型肝炎、耶尔森氏鼠疫杆菌感染、EB病毒感染、人类免疫缺陷病毒1型感染、病毒致癌、甲型流感病毒通路。升降散的抗病毒通路如此广泛，可以解释和证明升降散中医临床广泛用于治疗“杂气内郁”的合理内核，治疗瘟疫、温病、伤寒等杂症取得成就的科学内涵。推测升降散对SARS-CoV-2可能具有防治作用，对升降散中诸多化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2对接研究十分必要。

已有天然化合物与SARS-CoV-2相关靶蛋白分子对接诸多研究报道^[15-16]。对接过程中，活性中心Gridbox的大小设置合理与否直接会影响到分子对接的准确性。故本文以原配体抑制剂为活性口区域，合理设置分子对接的Gridbox大小。本研究通过TCMSP、CNKI、PubChem检索到升降散中已知化合物297个，其中117个化合物来源于大黄、133个化合物来源于姜黄、31个化合物来源于僵蚕、16个化合物来源于蝉蜕。上述各化合物分别与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2进行了分子对接。升降散中共有133个化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶进行分子对接的结合能数值小于−29.3 kJ/mol，其中大黄中的化合物有104个；升降散中共有145个化合物与ACE2进行分子对接的结合能数值小于−29.3 kJ/mol，其中大黄中的化合物有91个。推测大黄可能在升降散发挥潜在抗SARS-CoV-2作用中具有较大贡献。分子对接的结果显示，升降散与靶蛋白SARS-CoV-23CL水解酶、ACE2结合力强的化合物群比较庞大，可以预判升降散抗SARS-CoV-2的可能性大、作用好，可能是一个复杂的化合物群发挥作用。

从分子对接分析结果可知，综合评分较高的化合物大部分属于大黄中蒽酮和蒽醌类成分。《中国药典》2015年版记述大黄具有“泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄”的功效。大黄中具有泻下作用的活性成分主要是结合蒽醌类、蒽酮类^[17]，具有清热作用的主要是游离蒽醌类^[18]，这为升降散的君药为大黄之说提供了依据^[19]。升降散可能具有治疗COVID-19的潜在作用，推测君药大黄的贡献度较大，该结果还需要将来进行体内外活性研究进一步验证。