免疫治疗一直是肿瘤领域临床和基础研究的热点领域，而围绕如何提升肿瘤免疫治疗效果也有非常多不同的策略，如诱导肿瘤细胞免疫原性死亡、增加免疫细胞浸润、调控PDL1等免疫检查点表达、抑制免疫抑制微环境（细胞与成分）、增加免疫细胞识别、活化和杀伤等。如果大家有基金申请或者课题思路上的疑问可以联系我们进行咨询：今天我们通过仁济医院新近发表在Science子刊Sci Transl Med（中科院一区、IF 15.8）上的研究，看一下如何开展肿瘤免疫和免疫治疗相关研究。
研究发现蛋白酪氨酸磷酸酶受体T（PTPRT）缺失通过调节STING通路增强非小细胞肺癌（NSCLC）对抗PD-1治疗的敏感性。
发现PTPRT缺失的肿瘤细胞表现出DNA损伤累积、胞质DNA释放增加、肿瘤突变负荷增加，STING通路活化后释放更多IFN-β、CCL5和CXCL10，增强免疫细胞浸润，尤其是CD8+T细胞和自然杀伤细胞，从而提高PD-1治疗的效果。
即研究的作用信号轴为：PTPRT缺失——DNA损伤、胞质DNA释放——STING通路活化——IFN-β、CCL5和CXCL10等增加——免疫细胞（CD8+T和NK）浸润增加——提高PD-1抗体治疗效果。因此，研究的关键科学问题为：PTPRT缺失如何通过激活STING通路改善提高PD-1抗体治疗效果？
围绕这一关键科学问题，我们通过问题来看一下研究团队开展的工作。
首先是Q1：研究团队是如何选择PTPRT的？
即为何选择和确定PTPRT作为研究对象，而不是其它基因？
受体型蛋白酪氨酸磷酸酶RPTPs有20个成员，先前研究发现PTPRT去磷酸化STAT3的Y705位点和paxillin的Y88位点，调节细胞增殖、粘附和存活等过程。需要注意的是：PTPRT突变在多种癌症类型中普遍存在（结肠癌11%，肺癌10%，食管癌11%，胃癌9%，子宫内膜癌8%，头颈癌6%），并且磷酸酶结构域的突变降低了其酶活。
研究团队首先通过发现和验证队列基因突变进行分析，在这些基因中，PTPRT突变是唯一在CR/PR和DCB组中显著富集的基因：
发现和验证队列中PTPRT突变患者比WT患者的PFS更长，且磷酸酶突变（P-mut）患者比WT患者的PFS更长：
进一步分析发现PTPRT缺失的NSCLC患者中对PD-1抗体治疗更容易获益，PTPRT状态可作为预测抗PD-1治疗反应的一个独立标志物。
到这里，研究已经发现PTPRT缺失的非小细胞肺癌（NSCLC）患者对PD-1抗体治疗获益。
接下来的问题是Q2：PTPRT缺失是如何让患者对PD-1抗体治疗获益的？
这里有个非常关键的考虑角度：体细胞非同义编码突变产生的肿瘤特异性突变肽（新抗原）的更高负担可能会增加肿瘤的免疫原性，这些癌症患者更有可能从免疫检查点疗法中获益。而P-mut突变组的非同义编码突变等比例都最高：
因此重点关注PTPRT是否对DNA损伤或肿瘤突变负荷（TMB）有影响，这样就把PTPRT对免疫治疗响应的问题联系到了DNA损伤和肿瘤突变负荷TMB，因此下面就是验证PTPRT对DNA损伤和TMB的影响。
因此构建PTPRT基因敲除模型，检测了DNA损伤标志物p-γH2A的水平，并发现PTPRT缺失的细胞中DNA损伤增加；通过全外显子测序发现PTPRT缺失细胞的肿瘤突变负担（TMB）升高：
接下来就进一步探索PTPRT缺失后激活cGAS-STING通路的机制，同样构建PTPRT基因敲除细胞模型，结果发现，PTPRT缺失的细胞的细胞质DNA增加、STING增强、下游分子IRF3的磷酸化水平升高，同时伴随STING靶基因表达的上调，说明PTPRT缺失通过促进cGAS-STING通路的激活，可能增强肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性。
然后是Q3：PTPRT是如何激活STING通路的？
研究团队采用液相色谱串联质谱策略来鉴定HEK-293细胞中与PTPRT相关联的蛋白，结果发现STING是cGAS-STING通路中唯一与PTPRT相互作用的核心成员。接下来，通过免疫共沉淀和质谱确定STING与PTPRT相互作用，并发现PTPRT缺失的细胞中STING的Y240磷酸化水平升高，而PTPRT过表达则降低了这一磷酸化水平，说明PTPRT能够直接与STING相互作用并在Y240位点去磷酸化PTPRT。
在此基础上是另外一个问题：PTPRT降低STING的磷酸化，对STING蛋白的影响如何？
研究团队注意到在PTPRT缺失导致STING蛋白增加，但STING的mRNA表达无改变。于是通过环己酰胺（CHX）处理发现PTPRT影响了STING蛋白的降解。
接下来为了探究PTPRT缺失导致STING降解的机制，对细胞进行蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹处理，发现在PTPRT基因敲除细胞中STING的降解减少；免疫沉淀实验显示PTPRT的过表达增加了STING的泛素化，而PTPRT基因敲除则减少了STING的泛素化；此外PTPRT过表达显著降低了STING Y240磷酸化与总STING的比例，而PTPRT基因敲除则增加了这一比例。这些结果表明：PTPRT通过调控STING的Y240位点磷酸化状态，进而影响STING的泛素化和蛋白稳定性。
最后动物实验发现PTPRT缺失对肿瘤免疫微环境重编程，PTPRT缺失的肿瘤细胞在免疫能力完整的小鼠模型中促进了免疫细胞的浸润，特别是CD8 T细胞和自然杀伤（NK）细胞，PTPRT缺失的肿瘤在抗PD-1治疗下显示出更好的疗效，这种效应依赖于STING通路。1. 这个研究的角度是从TMB、STING通路的活化与提高免疫治疗效果切入的，与大家关注的免疫检查点的表达、降解不同；2. 研究有几个环节值得我们注意和思考：a. PTPRT是磷酸酶；b. PTPRT的基因组层面变化是点突变，而点突变的结果导致PTPRT的活性下降；c. PTPRT与肿瘤突变负荷TMB相关，而TMB已知与肿瘤免疫治疗响应率有关；d. PTPRT的直接底物是STING，通过去磷酸化导致STING蛋白的泛素化降解。如果我们也要开展这样的研究，以上这些环节中，要先做哪个？
