阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以记忆缺陷和认知功能减退为特征的神经退行性疾病，其主要神经病理学特征为神经元外β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）聚集成老年斑和细胞内高磷酸化Tau 蛋白积累形成神经原纤维缠结。已上市的常规药物只能改善AD 的临床症状，并不能有效延缓病情进展。随着对AD遗传学研究的深入，基因疗法成为当前最有希望治愈AD的治疗方法之一，其中小干扰 RNA（siRNA）基因疗法是当前的研究热点。
研究发现AD的发病机制极其复杂，与多个编码AD病理性蛋白的基因相关，如：淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、β-分泌酶-1（beta-secretase1，BACE1）、糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）、载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）和Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho associated coiled-coil containing protein，ROCKⅡ）等。
APP是编码淀粉样前体蛋白的基因，其多个位点突变被认为是导致AD的重要因素。APP被 β和γ分泌酶顺序酶切，会形成毒性Aβ 聚集体，并在大脑中沉积形成斑块而损害认知活动。研究表明于AD患者和AD前患者的神经元中引入病毒APP突变（A673T），可减少APP被 β分泌酶裂解，从而减少Aβ 的积累，有助于治疗此疾病。
APOE是编码载脂蛋白E的基因，参与脂质代谢和运输，主要在大脑星形胶质细胞和小胶质细胞中表达。研究表明激活APOE 基因会刺激APP转录，而APP被酶切会产生Aβ聚集体。而且在AD患者脑胶质细胞中APOE4表达上调，会引发神经炎症，加剧淀粉样蛋白和Tau病理，损害脑血管。此外 APOE4基因有遗传风险，易导致晚期迟发性AD，已有研究表明敲除此基因可显著改善 AD病理症状。
BACE1是编码β淀粉样裂解酶的基因，参与促进APP运输，与γ分泌酶形成复合物逐步裂解APP，产生毒性聚集性Aβ，且BACE1 切割是此途径发展为散发性AD的限速步骤。AD患者脑内 BACE1 蛋白的浓度显著升高，是AD早期阶段的生物标志物，也是突触重塑和可塑性的决定因素。有研究发现抑制BACE1表达可阻碍Aβ产生，改善APP转基因小鼠的神经变性和行为认知障碍，所以BACE1是AD基因治疗的首选分子靶点之一。
GSK3β是编码糖原合成激酶3β的基因，参与Tau蛋白的过度磷酸化表达，累积形成毒性低聚物，促使稳定的轴突微管分解，于神经元内聚集形成神经纤维缠结。此外GSK3β 还参与APP的代谢调节和Aβ 的产生，以及促进Aβ 诱导的神经元死亡。GSK3β是中枢神经系统炎症的常见靶点，研究发现抑制 GSK3β 的表达可以改善 AD病理小鼠体内p-Tau和神经纤维缠结的形成。
研究表明，编码蛋白激酶2的ROCKⅡ 基因在大脑中表达丰富，抑制其表达有利于神经元存活和突触再生。
siRNA 是最适合于针对编码蛋白质的基因进行短期沉默的手段，siRNA能够与目的基因序列互补并诱导降解相应的mRNA，使得mRNA 无法翻译成蛋白质，从而抑制病理性靶蛋白的产生，显示出在翻译水平治疗AD的潜力。siRNA发挥作用的机制为：双链 siRNA在细胞中被整合进RNA 诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），随后 siRNA的正义链被降解，反义链指导RISC识别与其碱基互补的mRNA，并与相应位点结合，使得复合体中的核糖核酸酶Ⅱ剪切靶mRNA，从而调节靶基因。siRNA疗法不干扰DNA，不会永久性修改基因组，毒副作用小，靶向能力强，但是siRNA 于体内外的稳定性、脱靶效应和细胞内外屏障等阻碍着其临床应用，尤其是血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）限制了siRNA 药物向作用位点的递送。目前主要通过基因治疗的局部传递策略递送siRNA，如侵入性给药，但此法有引发免疫和炎症的风险。
siRNA递送系统在体内传递过程中，一般会遇到3大障碍：体循环障碍、BBB、溶酶体和内涵体屏障。
siRNA的递送载体在进入体循环后要在血液中保持一定的稳定性。但是纳米载体作为外源性物质，容易被各种血浆蛋白标记，经过调理素作用，容易被单核吞噬细胞系统吞噬降解。 纳米载体的大小也会影响其在血液中的传递。研究表明，小于10nm的纳米颗粒会被肾脏清除，大于200nm的纳米颗粒会聚集在肝脏、脾脏及骨髓中，一般认为小于100nm的纳米颗粒适合脑内给药。纳米载体表面的Zeta电位小于-10mV时，容易被网状内皮系统 （reticuloendothelial system，RES）摄取。Zeta电位大于10 mV时则容易吸附血浆蛋白，也会增加在外周细胞的摄取，除此之外，还会造成溶血和血小板的聚集现象。接近中性的纳米粒，具有更长的循环半衰期，不良反应更少。因此，大部分学者认为，纳米载体的亲水性修饰或者多肽修饰后，可以改善纳米载体的表面性质，从而减少与血浆蛋白的结合。因此，纳米载体的尺寸、表面电荷及表面修饰等特性，直接影响其体内分布及循环时间的长短。
BBB的结构与功能在中枢神经系统中形成了多种生理屏障来保护大脑免受病毒、细菌，以及其他有害物质的侵害，这些屏障主要包括了BBB、血⁃脑脊液屏障、血⁃视网膜屏障、血⁃脊髓屏障。BBB位于脑实质和血液循环之间，由脑毛细管内皮细胞、细胞外基膜、周细胞、星形胶质细胞等组成，是限制98%小分子和近100%大分子药物进入大脑的主要屏障。人类大脑在生理状态下吸收营养物质以及排出废物主要依赖生理转运途径来完成，包括简单扩散、跨细胞亲脂途径、载体介导、外排泵、受体介导、吸附介导和细胞介导。
依据生理转运途径，科学家们已经找到了2种穿过BBB的方法，及侵入性与非侵入性。 侵入性的方法主要包括脑室内灌注、对流增强递送、植入中枢神经系统后直接释放治疗药物的聚合物或微芯片系统、采用物理化学等方法（聚焦超声、微波能量、电磁脉冲、甘露醇、阿拉伯胶、缓激肽等）进行BBB的瞬时破坏，但是这些方法可能会造成BBB的完整性和生理功能永久丧失，导致有害物质在大脑中积累，最终对大脑造成不可逆的损伤。阿拉伯糖、内酰胺等渗透促进剂的使用可能会造成脑水肿以及癫痫发作。保证BBB完整性是安全入脑的必要条件，因此吸附介导、受体介导、载体介导跨细胞转运途径、抑制外排泵途径、细胞介导途径等非侵入性穿过BBB是一种相对安全的方法。此外，非侵入性的方法还包括鼻脑转运通路。鼻腔给药主要是通过嗅球、三叉神经、脉管系统、淋巴系统绕过BBB到达神经中枢，是一种无创、安全、有前途的治疗方法，但这种途径的转运剂量和转运效率都很低。
由于吸附介导的非选择性，载体介导、细胞介导、鼻腔给药的局限性，抑制外排泵的危险性，受体介导的跨细胞途径成为研究者们的首选方法。受体介导地跨BBB方式不仅有很高的选择性，且该转运方式既可以转运特定的配体，也能转运配体功能化的偶联物或者纳米粒子，因而成为纳米药物靶向穿过BBB的最重要方式。
siRNA纳米递送载体穿透BBB进入细胞时形成早期内涵体，此时的pH在6.5～7.5；随后在内涵体中的ATP质子泵的作用下，大量的H＋被泵入到早期内涵体中，使pH进一步降低至5～6.5，促进了晚期内涵体的形成；晚期内涵体进一步与溶酶体融合siRNA 浸润在酸性和各种消化酶的环境中，导致siRNA 降解失活。因此，siRNA必须快速地从内涵体或溶酶体中逃逸出去，才能使siRNA保持活性。但不幸的是，大部分被细胞摄取的siRNA 纳米载体都被困在晚期内涵体和溶酶体中，只有1%～3%的siRNA 成功完成内涵体和溶酶体的逃逸。目前逃逸内涵体和溶酶体的机制主要有质子海绵效应、降低膜的稳定性（膜融合、孔洞形成）、光化学内化。其中质子海绵效应已经成为siRNA 逃逸内涵体的主要途径。因此，一个优良的siRNA 纳米载体是实现高效脑部递送，并在靶细胞快速释放的关键。
参考资料
[1]张瑶瑶,苏峰,曹俊如,等.阿尔茨海默病的小干扰RNA疗法药物递送研究进展[J].中国新药杂志,2024,33(15):1571-1579.
[2]苏峰,熊峰,曹俊如,等.基于穿透血脑屏障的siRNA纳米递药系统研究进展[J].中国药学杂志,2024,59(04):285-295.
作者简介
小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。
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