研究背景

缺血性中风是全球致残和致死的主要原因之一，其发病机制复杂，主要由脑缺血/再灌注（I/R）损伤引起。TRPM2通道是一种非选择性阳离子通道，参与多种钙依赖性生理过程，其过度激活与I/R诱导的神经损伤密切相关。然而，现有的TRPM2抑制剂存在活性不足或特异性差等问题，限制了其临床应用。因此，开发新型TRPM2抑制剂具有重要意义。

重点内容

①TRPM2抑制剂的发现： 通过化学库筛选，研究人员发现了一种新的TRPM2抑制剂A1，其具有吲哚嗪骨架结构。A1在体外实验中表现出高选择性和强抑制活性，能够显著抑制TRPM2通道的活性。

②结构优化与活性评估： 基于A1的结构，研究人员设计并合成了43种吲哚嗪衍生物。通过钙荧光和电生理实验，筛选出5种具有显著抑制活性的化合物（A1、D10、D14、D15和D18），其中D10的抑制活性最强，IC ₅₀ 值为2.29 μM。

③体外神经保护效果： 在氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型中，D10等化合物表现出显著的神经保护效果，能够有效减轻细胞死亡，效果优于临床药物依达拉奉。

④体内药效评估： 在小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型中，D10在再灌注后24小时给药，并持续治疗7天，显示出显著的抗中风活性和生存率提升，效果优于依达拉奉。

研究总结

本研究通过化学库筛选，发现了一种新的TRPM2抑制剂A1，并基于其结构设计合成了43种吲哚嗪衍生物。其中，化合物D10表现出优异的TRPM2抑制活性和神经保护效果，其在体外实验中能显著减轻氧糖剥夺/再灌注诱导的细胞死亡，在体内模型中也能有效减少脑梗死体积，且治疗效果优于临床药物依达拉奉，展现了良好的成药潜力。

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01

Background

缺血性中风是全球致残和致死的主要原因之一，约60%至70%的中风病例由缺血引起。 缺血性中风后，由缺血/再灌注（I/R）诱导的脑损伤产生的活性氧（ROS）在随后的损伤中起关键作用，影响细胞大分子并诱导自噬、凋亡和坏死。再灌注损伤主要归因于ROS的二次激增，这显著导致不可逆的脑损伤和神经功能障碍。缺血性中风的病理生理过程复杂，静脉溶栓或血管内介入治疗的治疗窗口狭窄。近年来，尽管提出了许多相关靶点和创新治疗策略，但其转化为临床实践仍然困难。因此，基于新靶点开发有效的缺血性中风保护剂是合理的方法。 自1998年首次从人脑中分离以来，瞬时受体电位梅拉斯坦2（TRPM2）被鉴定为瞬时受体电位（TRP）超家族的成员，位于细胞膜上，是阳离子通透性通道。TRP通道在大脑、肾脏、心脏和骨髓中广泛分布，其中大脑表达最高。TRPM2作为一种非选择性阳离子通道，促进Na⁺和K⁺的通透性，同时允许Ca²⁺通透。 TRPM2参与多种钙依赖性生理过程。研究表明，TRPM2的过度激活与I/R诱导的神经损伤密切相关，这种激活依赖于ROS的释放。此外，使用敲除小鼠的研究表明，抑制TRPM2的表达有助于保护神经元免受I/R损伤。然而，迄今为止报道的大多数TRPM2抑制剂表现出抑制活性不足或缺乏特异性，从而限制了它们的潜在临床应用。

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02

Drug Design

①药物设计

在研究中，通过筛选自建的含氮杂环化合物化学库，发现了一种具有独特结构的吲哚嗪衍生物A1，它是一种新的TRPM2通道抑制剂。实验显示，A1（30 μM）几乎能完全抑制TRPM2通道的活性。通过荧光钙成像和全细胞膜片钳实验验证了A1对TRPM2的抑制效果，并且A1对其他常见的钙离子通道（如ASIC1a、NMDAR、TRPC6、TRPV1、TRPV4和TRPM8）没有显著的抑制作用，表现出高选择性。进一步的定点突变实验表明，A1的结合位点可能位于TRPM2通道的细胞外区域，特别是氨基酸残基E994、H995、E1010和E1022所在的区域。此外，A1在大鼠体内的药代动力学实验显示其具有较好的药物代谢特性，这为后续基于A1的结构优化和新药研发提供了重要的基础。

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②构效关系研究

研究人员对合成的43种吲哚嗪衍生物（A1−A13、B1−B3、C1−C3和D1−D24）进行了生物活性评估。这些化合物在30 μM浓度下对过氧化氢诱导的Ca²⁺内流表现出不同程度的抑制活性。其中，20种化合物在30 μM时能显著降低Ca²⁺荧光，抑制率约50%。通过全细胞膜片钳实验进一步确认了这些化合物对TRPM2通道的抑制效果。在10 μM浓度下，A1、D10、D14、D15和D18五种化合物的抑制效果超过70%，且在1 μM时仍表现出良好的抑制活性，其IC ₅₀ 值在2.29 μM到3.28 μM之间，D10的抑制活性最强（IC ₅₀ = 2.29 μM）。

构效关系（SAR）分析表明，吲哚嗪结构单元中的苯基部分对活性至关重要，引入其他芳香杂环或在苯环上引入较大取代基会降低或消除活性。例如，A1中的苯基被氟代（A2）时活性略有下降，而被氯（A3）、溴（A4）或甲基（A5）等取代时活性显著降低。此外，A1中的羰基也是活性的关键官能团，将其还原或替换为其他基团会导致活性丧失。研究还发现，将A1的酯基单元替换为适当的酰胺基团可以增强抑制活性。例如，D10中的二乙基酰胺基团显著提高了活性。

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03

In vitro In Vivo

①A1衍生物对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞死亡的保护作用

首先，通过CCK-8实验验证了这些化合物在0.1−30 μM浓度范围内对细胞生长无显著抑制作用，表明它们具有良好的生物相容性。随后，研究人员利用氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型模拟神经缺血和兴奋毒性，评估了A1、D10、D14、D15和D18这五种化合物的保护活性。实验结果显示，与OGD/R处理的细胞相比，这些化合物在0.3−3 μM浓度下均显示出与依达拉奉相似或更强的保护效果，尤其是D10在0.3、1和3 μM浓度下表现出显著的保护活性。这些数据表明，A1衍生物在体外模型中对神经细胞具有显著的保护作用，为进一步的体内实验提供了有力支持。

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②体内药代动力学（PK）研究

研究人员对化合物D10进行了体内药代动力学（PK）研究，以评估其在动物模型中的药物代谢特性。实验中，D10通过单次静脉注射（1 mg/kg）和口服给药（20 mg/kg和100 mg/kg）的方式分别在小鼠体内进行测试。结果显示，静脉注射后，D10的半衰期（T _1/2 ）为0.86小时，最大血药浓度（C _max ）为0.26 μg/mL，药时曲线下面积（AUC _0−∞ ）为0.22 h·μg/mL，清除率（CL）为75.76 mL/min/kg，平均滞留时间（MRT）为1.24小时。口服给药后，D10在20 mg/kg剂量下的T _1/2 为2.62小时，C _max 为0.33 μg/mL，AUC _0−∞ 为2.41 h·μg/mL，CL为52.63 mL/min/kg，MRT为2.65小时；在100 mg/kg剂量下，T _1/2 为2.83小时，C _max 为1.52 μg/mL，AUC _0−∞ 为11.74 h·μg/mL，CL为52.12 mL/min/kg，MRT为3.16小时。此外，D10在20 mg/kg和100 mg/kg口服剂量下的生物利用度（F%）分别为50.04%和48.18%，表明其具有较好的口服吸收特性。这些药代动力学参数表明D10具有良好的药物代谢特性，为后续的体内疗效评估提供了重要依据。

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③通过小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型评估了化合物D10对缺血性脑损伤的保护效果

实验中，小鼠接受90分钟的tMCAO处理后，在再灌注3小时时给予D10（0.3、1或3 mg/kg，静脉注射）或依达拉奉（3 mg/kg，静脉注射）治疗。结果显示，与生理盐水处理的对照组相比，1 mg/kg和3 mg/kg剂量的D10显著减少了脑梗死体积，效果与依达拉奉相当，而3 mg/kg剂量的D10在减少脑梗死体积方面甚至优于依达拉奉。此外，D10在1 mg/kg和3 mg/kg剂量下还显著改善了小鼠的神经功能评分，表明其对局灶性脑缺血诱导的脑梗死具有显著的保护作用，且效果至少与临床应用的神经保护剂依达拉奉相当。这些结果进一步证实了D10作为一种潜在的缺血性中风治疗药物的潜力。

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