巨噬细胞的炎症反应激活以及焦亡，会导致脓毒症的产生，今天要看的这篇中国药科大学发表在10.7分的Redox Biol.上的文章，讲的就是TrxR1抑制剂对于巨噬细胞中Caspase11以及炎性小体的抑制（NLRP3炎性小体和Caspase11其实就是造成焦亡的关键，不熟悉细胞焦亡的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列），从而缓解脓毒症：
他们研究的抑制剂是TrxR1的抑制剂Auranofin，这个一般是用来治疗脓毒症的，但是机制还是不太清楚。他们对CLP诱导脓毒症的模型小鼠使用了抑制剂后，发现Auranofin减轻CLP诱导的脓毒症症状，同时也缓解了小鼠肝脏和肺中的细胞焦亡（这里他们分析了Caspase11的磷酸化，以及GSDMD的N末端水解情况，N端的GSDMD会上膜形成穿孔，这个就是细胞焦亡的基本验证项目，不清楚的话可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列里的细胞焦亡那几章）：
脓毒症其实和巨噬细胞的过度激活有着比较密切的联系，于是他们分析了一下TrxR1的抑制剂对于巨噬细胞的影响，E. coli（大肠杆菌）会通过LPS过度激活巨噬细胞的Caspase11，导致巨噬细胞焦亡增加。而通过TrxR1的抑制剂处理后，则发现巨噬细胞中的细胞焦亡和Caspase11以及炎性小体激活得到了抑制：
那么TrxR1具体通过什么途径影响了下游的细胞焦亡呢，他们通过对TrxR1的酶功能结构的突变，验证了其酶活性是导致下游细胞焦亡的关键（其实这一点就已经很不错了，通过突变缩小了验证的范围，确定了那个具体的点，避免了肯定后件的逻辑谬误）。而TrxR1作为还原酶发挥作用，主要是调节Trx1的氧化还原状态，于是他们分析了Trx1是否也参与了细胞焦亡以及Caspase11和炎性小体的激活：
虽然这个过程他们使用了敲减Trx1（这其实也是柯霍氏法则验证的一个手段，也就是通过移除Trx1验证其是否起到了关键作用，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），但这明显也是不够的，于是他们就针对Trx1也进行了活性位点的突变，通过突变Trx1验证确认TrxR1是通过维持Trx-1的还原活性来控制焦亡和Caspase11及炎性小体的激活：
LPS要进入巨噬细胞，是需要通过OMV（外膜囊泡）发生内吞的，那么TrxR1对于LPS的内吞以及OMV是否有一定的影响呢？于是他们敲减TrxR1后，分析了OMV以及LPS的定位，他们发现早期和晚期的OMV以及LPS的定位都会受到TrxR1的调控。而通过使用了小窝蛋白内吞抑制剂后发现，TrxR1可能调节小窝介导的内吞作用，从而影响OMV及其中的LPS的摄取：
在小窝介导的内吞途径中， CAV1（小窝蛋白1）在囊泡形成和随后的物质内化中，起到了关键作用。而TrxR1敲减，则增强了Trx1与CAV1的共定位。也就是说TrxR1对于Trx1的还原可能会降低Trx1与CAV1的结合，接着他们通过还原剂以及氧化剂，以及活性位点突变了的Trx1，对Trx1与CAV1的结合进行了coIP分析（看不懂coIP图的话，可以回去看看《夏老师带你读文献》，都介绍过怎么看），确定了氧化的Trx1会与CAV1结合：
接着为了确定TrxR1-Trx1轴对于CAV1的膜定位，他们又进行了上下游之间关联性的验证，这里他们并没有直接敲减TrxR1后过表达Trx1，而是敲减TrxR1后分别过表达Trx1及其突变体，通过Trx1的突变，来确定TrxR1是通过还原Trx1，导致了下游的CAV1的上膜以及维持了CAV1的蛋白水平（这样的突变验证其实就是有效地避免了肯定后件逻辑谬误，在很多高分的文章中，这都是比较常用的验证手段了，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以回去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
最后他们通过敲减了TrxR1后，回复表达CAV1，确定了CAV1过表达可以恢复敲减TrxR1后导致的焦亡抑制（其实这一步验证还是有点仓促了，如果是验证CAV1与Trx1结合位点的突变，会更有说服力一些）。通过这个实验，他们确定CAV1的过表达，可以挽救TrxR1调节的焦亡和Caspase11炎性小体激活：
最后，他们形成了这样的示意图，TrxR1还原了Trx1，而还原后的Trx1无法结合CAV1，而游离的CAV1会促进OMV的内吞，促进LPS进入细胞，导致Caspase11炎性小体的激活，导致了巨噬细胞的焦亡。而当TrxR1被抑制后，氧化的Trx1会结合CAV1，降低CAV1的上膜以及其蛋白水平，从而抑制LPS通过OMV进入细胞，抑制LPS对于巨噬细胞的过度激活，缓解脓毒症：
总的来说这篇文章大部分的验证，都是有条理也是比较有逻辑的，就是在最后验证CAV1作为TrxR1-Trx1后的一环的过程，可能稍微有一点仓促了。总的来说是一篇不错的文章，好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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