点评丨田瑞军（南方科技大学）、董梦秋（NIBS）、韩硕（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）
蛋白质-蛋白质的相互作用广泛存在于各种生命过程中，对机体维持正常发育、行使正常生理功能等十分关键。邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术是一种利用蛋白质分子间的空间接近关系以大规模精确鉴定未知蛋白质-蛋白质相互作用及其动态变化信息的生物学工具，对于生物学功能的探索和疾病发生机制的理解具有重要的意义。目前以APEX2为代表的过氧化物酶介导的邻近标记工具因其依赖于具有细胞毒性的过氧化氢而无法应用于活细胞及活体中，而以TurboID为代表的生物素连接酶介导的邻近标记虽然可以用于活细胞及活体标记，但仍然需要至少1-10分钟的标记时间，标记效率不高。因此，在活体及活细胞体系中深入剖析生命进程中瞬息万变的蛋白质-蛋白质相互作用，尤其是它们在动态环境下的瞬时互作，仍旧是一项极具挑战性的任务。2024年12月10日，中国科学院上海营养与健康研究所潘巍峻团队在Cell Research上在线发表了题为Photoactivated SOPP3 enables APEX2-mediated proximity labeling with high spatio-temporal resolution in live cells的研究性论文。该研究报道了一种基于光敏蛋白SOPP3和过氧化物酶APEX2的新型邻近标记技术。在深入研究中，本文作者突破性地发现，光敏蛋白SOPP3在短暂的5-10秒蓝光照射下，能够在活细胞中直接触发APEX2的邻近标记活性，从而首次在活细胞中实现了无需过氧化氢参与、且具备更高时空分辨率的邻近标记。通过对潜在的可以在光刺激下激活APEX2的光敏蛋白家族进行筛选，作者发现SOPP3可以在蓝光刺激下通过超氧化物歧化酶（SOD）直接激活APEX2介导的邻近标记反应（图1）。
图1. APEX2-SOPP3介导的邻近标记反应原理图
接下来，作者将APEX2以及SOPP3分别表达于线粒体外膜以及内质网外膜，发现5-10秒的蓝光刺激即可激活APEX2和SOPP3在线粒体-内质网交界面的邻近标记反应（图2）。进一步通过高分辨率光学成像以及质谱定量分析证实了该标记方法在空间上具有良好的特异性，并且作者还鉴定到一组未被报道过的蛋白，为研究线粒体-内质网互作奠定了坚实的基础。
图2. APEX2-SOPP3介导的线粒体与内质网交界面内邻近标记反应
除了对细胞内特定区域的蛋白质进行标记，作者还将APEX2-SOPP3介导的邻近标记反应拓展至细胞与细胞之间的交界面，发现该系统不仅实现了亚细胞器间的邻近标记，而且实现了细胞间的邻近标记。
为了进一步拓展该标记技术的应用场景，作者将APEX2与SOPP3进行了融合表达，并将该融合蛋白表达于多种亚细胞区域，发现其均能在5-10 秒内实现高时空特异性的邻近标记。其中，表达于细胞外膜的APEX2-SOPP3可以对邻近的细胞进行高效且特异的标记，展现出该技术在细胞微环境解析当中的巨大潜力。相较于其他标记方法，基于APEX2与SOPP3介导的邻近标记方法展现出了显著的优势。首先，其具备秒级的高效标记效率，能够迅速捕捉蛋白分子的瞬时动态互作。其次，该技术对APEX2与SOPP3两种蛋白的空间距离有着极高的敏感度，且该技术对蓝光的依赖性使得研究者能够精确且严格地对特定区域进行标记，并能够控制标记反应的开始与结束，使其在复杂的细胞环境中达到更为精准的标记，为实验提供了高度的灵活性和可控性。最后，与依赖过氧化氢的传统APEX2标记技术不同，APEX2-SOPP3标记系统几乎不产生细胞毒性。因此，与其他邻近标记方法相比，APEX2-SOPP3标记系统在标记效率以及细胞毒性方面均展现出了显著的优势，为生物学、医学等领域的研究提供了强有力的技术支持。另外，为方便他人使用，本篇工作中的关键质粒及其设计均已通过Addgene作为开源平台公开提供(229077, 229075, 229074, 229073, 229072, 229071)。综上，通过将光敏蛋白与邻近标记酶结合，作者开发的APEX2-SOPP3邻近标记技术将传统标记技术的时间分辨率从分钟级（1-10分钟）提升到了秒级（5-10秒），为在活细胞中研究具有高度动态性的蛋白质组提供有力的技术支持。中国科学院上海营养与健康研究所博士生屈大均和李雅昕以及中国科学院上海药物研究所博士后刘倩为本文的共同第一作者。中国科学院上海营养与健康研究所潘巍峻研究员和张文娟博士后以及中国科学院上海药物研究所周虎研究员为本文的共同通讯作者。
这篇论文提出了一种创新的邻近标记（PL）技术，解决了传统方法中存在的多项挑战，具有很高的应用潜力。文章描述了一种基于光控制的APEX2激活方法，通过使用SOPP3（单态氧光敏蛋白）与APEX2结合，在不需要外源H2O2的情况下，通过蓝光激活产生反应性ROS，从而高效、精确地标记邻近蛋白质。传统的邻近标记技术如APEX2依赖于外源性H2O2，往往伴随细胞毒性，这大大限制了其在活细胞中的应用。与此相比，SOPP3介导的APEX2激活不仅避免了H2O2的使用，而且可以通过光照精确调控标记过程，且该过程无细胞毒性，标记速率高，5秒内即可完成。
作者通过多种实验验证了该技术的高效性和空间分辨率，特别是在不同亚细胞位置（如线粒体外膜、内质网及细胞表面）上的应用，展示了其在探测动态蛋白质相互作用中的潜在优势。通过定量蛋白质组学分析，本论文还识别了大量新的线粒体-内质网接触位点蛋白质，进一步证明了该方法不仅可以确认已知相互作用，还能发现新的潜在蛋白质相互作用。与传统的BioID和TurboID方法相比，该系统显著提高了时间分辨率。另外，该方法的低功率光照需求（50 mW/cm²）保证了其在活细胞中的安全性，避免了其他方法中可能引起的细胞损伤。与LITag和LOV-Turbo等现有光激活系统相比，SOPP3介导的APEX2激活在效率和安全性上具有优势。总之，本文介绍的SOPP3介导的APEX2系统是一项新的邻近标记技术，具有高时间分辨率优势，为研究动态细胞机制的蛋白质组学分析提供了新颖的工具。
有时候专业领域内的难题需要局外人帮忙解决。中国科学院上海营养与健康研究所潘巍峻团队无意间发现，一种在蓝光照射下高效产生单线态氧的小蛋白SOPP3和APEX2联用可以在不需要外加双氧水的情况下实现邻近标记，而且速度非常快，仅5-10秒就能完成标记反应。与同类最新技术LITag（Light-induced Interactome Tagging，Hananya, N., PNAS, 2023）相比，SOPP3-APEX2将标记所需的光照强度降低了一个数量级，从而避免了蓝光照射产生的细胞毒性。SOPP3-APEX2让三无（无需外加双氧水、无细胞毒性、无需等待）、双高（高时间分辨、高空间分辨）活细胞邻近标记技术成为现实，为精准刻画蛋白-蛋白相互作用的动态提供了更高效的工具，应用场景无限。
从质谱分析的角度，SOPP3-APEX2让人既兴奋又倍感压力。邻近标记蛋白的鉴定依赖质谱技术。高时空分辨的邻近标记意味着被标记蛋白的种类和绝对量骤减，富集纯化过程中更容易被未标记蛋白污染。因此，质谱鉴定的灵敏度和准确度必须上一个台阶。除了用相对定量方法排除背景蛋白，可能也有必要鉴定被生物素-苯酚修饰的肽段，以降低假阳率。作为质谱人，我深知这是一个巨大的挑战。但是，办法总会有的。
工程化的过氧化物酶APEX最早由Alice Ting实验室开发，原本用作电子显微镜的报告基因（Martell, Nat Biotech 2012），于2013年首次用于邻近标记空间蛋白质组学和鉴定细胞中时空特异的分子组分（Rhee, Zou, Science 2013），建立了邻近标记方法的范式，而后又进一步通过定向进化升级为活性更高的APEX2（Lam, Nat Method 2014）。过去十年间，APEX2的广泛应用促成了一系列有趣的发现（例如朱冰课题组Ma, Nature 2024），但始终受到标记时空分辨率、反应细胞毒性、标记可控性等问题的困扰。
本篇工作中，潘巍峻团队屈大均等意外地发现了遗传编码的光敏剂蛋白SOPP3在光照条件下可激活APEX2，并阐明了SOD依赖的反应机制，为应用APEX2邻近标记提供了全新的思路。该策略的优势在于可以通过蓝光的开启和关闭灵活控制反应起止，有效减少了细胞毒性。同时，该工具的亮点在于可将激活模块SOPP3和标记模块APEX2分别表达于不同的亚细胞区域，从而实现空间交集处特异的标记与组成鉴定，相较于现有的split APEX2（高背景，低活性）具有巨大优势，在研究细胞器互作等领域有很大前景。此外，作者还将该方法从分子水平拓展到了细胞层面，实现了具有极高时间分辨率的邻近细胞间互作标记。非常期待未来SOPP3-APEX2方法的推广应用所带来的生物学新发现。
https://www.nature.com/articles/s41422-024-01061-9制版人：十一
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