【高分综述 053】通过全面的分子分析识别多发性骨髓瘤的精细拷贝数和表达亚型

• 多发性骨髓瘤是一种可治疗但目前无法治愈的血液系统恶性肿瘤，其特征是肿瘤遗传学的多样性和复杂性，目前尚缺乏精准医疗方法。

• 本文通过“与多发性骨髓瘤遗传谱个人评估相关的临床结果研究”（CoMMpass研究，NCT01454297），对新诊断的多发性骨髓瘤患者（n=1,143）进行了纵向观察性临床研究。

• 研究中，肿瘤样本在诊断和疾病进展时通过全基因组测序、全外显子组测序和RNA测序进行特征分析，同时每三个月收集一次临床数据。

• 基线队列分析识别了复发性功能增益和功能丧失事件的靶标基因，并通过共识聚类识别了8个独特的拷贝数和12个表达亚型，揭示了高风险遗传亚型并阐明了这些独特生物学组的许多分子基础。

研究队列描述

• 队列的人口统计学和临床参数遵循预期分布，中位诊断年龄为63岁（范围27-93岁），男性预期过多（60.4%），国际分期系统（ISS）分布为35.1% ISSI，35.1% ISSII和27.2% ISSIII。

• 该队列主要来自美国，与大多数临床试验不同，自报祖先的分布反映了美国人口普查局的统计数据，其中80.6%为白人，17.5%为黑人，1.9%为亚洲人。

• 通过全基因组测序定义的每位患者的细胞遗传学表型，57.2%为高风险疾病（HRD），42.8%为非高风险疾病（NHRD），24.3%为1p22缺失，35.2%为1q21增益，52.0%为13q14缺失，12.5%为17p13缺失。

整合分析获得和失去功能基因

• 为了全面识别多发性骨髓瘤患者中的获得功能（GOF）和失去功能（LOF）事件，研究团队开发了一个综合模型，该模型通过结合全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）和RNA测序（RNA-seq）的数据，为每个基因分配一个功能状态。

• 在失去功能模型中，如果一个基因中发生了单一事件，则被指定为部分失去功能，而如果一个基因中发生了两个或更多的事件，则被指定为完全失去功能。

• 在诊断时，592名患者进行了全部三种测序检测并被纳入分析。研究团队识别了70个基因，在这些基因中，至少有5名患者发现了完全LOF事件。

• 在这些基因中，有12个基因在超过2%的队列中观察到完全LOF，包括TRAF3（10.1%）、DIS3（6.9%）、TENT5C/FAM46C（5.1%）、CYLD（4.7%）、TP53（4.1%）、MAX（3.5%）、RB1（3.2%）、WWOX（3.2%）、HUWE1（2.7%）、PVT1（2.5%）、CDC42BPB（2.0%）和MAGEC1（2.0%）。

• 然而，CDC42BPB与TRAF3位于同一个染色体区域，之前已经显示这个区域的双等位基因缺失。

• 在13号染色体的丢失中，WGS数据显示52.0%的患者存在13q14的缺失，而LOF分析发现26.5%的患者存在13号染色体上一个或多个基因的完全LOF。

• 通常假定的目标基因RB1在3.2%的患者中显示完全LOF，而DIS3的完全LOF在6.9%的患者中被检测到；然而，还有许多其他基因在骨髓瘤中独立地被敲除。

• 研究还发现了两个具有完全LOF的连续基因区域：第一个包括MPHOSPH8（1.4%）、PSPC1（1.5%）、ZMYM5（1.4%）、ZMYM2（1.0%），第二个包括TGDS（1.9%）和GPR180（0.8%），最小的缺失区域和LOF频率表明PSPC1和TGDS分别是目标基因。

• 这些结果突出表明，单体13号染色体与多个独立基因失活事件相关。

图1. 至少有五名患者在诊断时发生的反复LOF和GOF事件，按事件频率排序。每个基因的位置和邻近性都在交替的灰色和黑色条旁边显示，说明染色体位置何时变化，而直接位于右侧的黑色条表示相邻基因。x轴上的每个刻度代表具有相应事件的患者。a、在53个常染色体定位的基因中观察到完全LOF。b、在基线队列中至少有五名患者中，chr13q上的基因是完全LOF事件的目标。c、由于扩增、基因融合、突变或与结构变异（SV）相关的过度表达，在27个常染色体基因中检测到GOF事件。

多发性骨髓瘤拷贝数亚型的鉴定

• 研究者通过无监督共识聚类分析了871名患者的拷贝数数据，以探索HRD和NHRD核型之外的亚型，从而发现了八个独特的亚型。

• 这些亚型包括五个HRD和三个NHRD亚型，它们根据特定的遗传特征进行了分类和注释。

• HRD经典亚型表现出了典型的染色体增益，而其他HRD亚型则根据与此标准型的偏差进行了定义。

• 例如，HRD, ++15亚型表现出chr15的四体性，而HRD, diploid 7和HRD, diploid 3, 7亚型则因缺少特定的染色体三体性而被区分。

• 在NHRD亚型中，二倍体亚型通常缺乏拷贝数变化，并与D型细胞周期蛋白的易位高度相关。

• 另外两个NHRD亚型与免疫球蛋白易位相关，并且以chr13的丢失为特征。

• 尽管HRD和NHRD患者之间没有观察到预后差异，但具有1q增益和chr13丢失的HRD和NHRD亚型患者的总生存期较差。

• 特别是，+1q, −13亚型与−13亚型之间的OS差异表明，1q增益可能比13q丢失更影响预后。

图2. 多发性骨髓瘤的拷贝数亚型。a, 对WGS拷贝数数据的共识聚类分析确定了八个独特的拷贝数亚型，包括五个高风险疾病（HRD）和三个非高风险疾病（NHRD）亚型，这些亚型是根据常见的拷贝数特征进行注释的。b, 针对每个拷贝数亚型的逐点总生存（OS）估计值通过各自的线条显示。对于HRD, +1q, 二倍体11, −13（55.7个月，95% CI = 31.7–NA（不可用）），+1q, −13（69.3个月，95% CI = 53.0–97.4），HRD, 二倍体3, 7（95.3个月，95% CI = 43.6–NA）和−13（103.9个月，95% CI = 79.2–NA）亚型，达到了中位OS。通过使用Benjamini-Hochberg方法进行多重测试校正后的log-rank检验，识别出八个具有显著差异的亚型。显著差异存在于HRD, +1q, 二倍体11, −13亚型与HRD, ++15（P = 0.0015）、HRD, 经典型（P = 0.0373）、二倍体（P = 0.0373）或−13（P = 0.0373）之间；存在于+1q, −13亚型与HRD, ++15（P = 0.0015）、HRD, 经典型（P = 0.0373）或二倍体（P = 0.0448）之间；以及HRD, ++15与HRD, 二倍体3, 7（P = 0.03733）之间。c, 逐点OS估计值通过各自的线条显示，并通过log-rank检验比较了成对结果，显示+1q, −13和HRD, +1q, 二倍体11, −13组（中位数 = 67.2个月，95% CI = 53.0–83.2）与其他拷贝数亚型患者（中位数 = 103.9, 95% CI = 103.9–NA）之间存在显著差异（P = 9.5 × 10^-6）。

多发性骨髓瘤的RNA亚型

• 研究者通过共识聚类分析了714个基线样本的RNA测序结果，以识别由基因表达定义的多发性骨髓瘤亚型。

• 通过三次独立的重复实验，确定了12个集群作为最佳解决方案，其中两次结果完全相同，第三次有2.8%（20名患者）被分配到不同的类别。

• 许多观察到的亚型与已知的免疫球蛋白易位和拷贝数状态有关，与先前研究中识别的亚型有清晰的关联。

• 研究确定了四个在所有研究中都能识别的亚型，包括表达MMSET（MS）（由t(4;14)患者特征化）、MAF家族转录因子表达（MAF）（主要由t(14;16)患者特征化）、高表达D型细胞周期蛋白的群组1（CD1）（由t(11;14)患者特征化）和增殖（PR）（由具有高增殖指数的患者特征化）。

• 为了在不同研究中保持一致性，适当时使用了先前研究中的亚型名称，否则基于共同的分子特征进行了命名。

• MS亚型包括10.6%的患者，其中62个样本（92.5%）通过WGS检测到t(4;14)-WHSC1。

• MAF亚型包括6.4%的患者，其中38个（92.7%）有易位，包括27个t(14;16)-MAF、4个t(8;14)-MAFA、6个t(14;20)-MAFB和1个t(20;22)-MAFB。

• 所有三个没有可检测到的免疫球蛋白易位的患者都有MAF家族基因的高表达。

• 与MAF家族转录因子易位相关的免疫球蛋白易位与较高的突变负荷有关，在该队列中，10名具有高肿瘤突变负荷（每Mb超过10个突变）的患者中有8名在MAF亚型中，可能适合接受检查点抑制剂治疗。

• 研究还识别了与D型细胞周期蛋白过表达高度相关的三种亚型，这些过表达由t(11;14)-CCND1、t(12;14)-CCND2或t(6;14)-CCND3引起。

• CD1亚型包括4.3%的患者，其中24个（96%）有D型细胞周期蛋白靶向易位。

• 研究还识别了两个与CD2相关的亚型，称为CD2a和CD2b，它们与细胞表面表达CD20相关，这在其他RNA亚型中大多缺失。

RNA亚型与临床和分子关联

• 为了识别每个RNA亚型的额外定义特征，研究者测试了临床和分子特征（包括完全LOF和GOF事件）之间的显著关联。

• 总体而言，21个基因的完全LOF或GOF与一个或多个RNA亚型有显著关联。正如预期的那样，GOF在与MAF、MS和CD亚型相关的易位靶标基因中被检测到。

• 尽管在t(14;16)中预期只有一个WWOX等位基因的丢失，但经常检测到WWOX的完全LOF（P < 0.001），支持WWOX在骨髓瘤中可能的作用。

• MS和1q增益亚型中NRAS GOF的缺失，以及后者中TRAF3 LOF的富集。

• CD2a亚型富集了NRAS（P < 0.005）和IRF4（P < 0.005）的GOF事件，而CD2b亚型富集了IRF4（P < 0.005）和EFTUD2（P < 0.01）的GOF事件，代表了潜在的亚型特异性治疗靶标。

• 一般来说，HRD RNA亚型没有富集任何GOF或LOF事件，除了HRD, ++15, MYC亚型，它富集了FAM46C的LOF事件（P < 0.001）。

• PR亚型富集了RB1（P < 0.001）和MAX（P < 0.01）的LOF、gain(1q21)（P < 0.001）、del(13q14)（P < 0.001）和ISSIII患者（P < 0.001）。

• 有趣的是，50%的PR患者是ISSIII，而22%和28%的PR患者分别是ISSI和ISSII，突出显示ISS在一半这些高风险患者中低估了疾病严重性。

图4. RNA亚型及显著相关的LOF和GOF事件。每个基因的位置和邻近性都在交替的灰色和黑色条旁边显示，说明染色体位置何时变化，而直接位于右侧的黑色条表示相邻基因。在特定RNA亚型中显著富集或耗尽的LOF和GOF特征都被突出显示。富集分析是使用双尾费舍尔检验进行的，并且使用了Benjamini-Hochberg检验校正进行多重测试，以计算阳性假发现率（pFDR）值。只有当pFDR ≤ 0.1，P < 0.05时，才包括基因。

G1/S检查点与向PR亚型转变的关联

• 研究者开发了一个预测模型，用于将序列样本分配到具有最高类别概率的亚型。总共71名患者至少在两个时间点被分配了亚型，其中55名患者至少在两个时间点被分配了非低纯度亚型。

• 在诊断时，五名连续患者被分类为低纯度；然而，在进展时，他们都有非低纯度的亚型，进一步支持了这一表型是由相对样本纯度而非独特的疾病生物学驱动的观点。

• 尽管大多数患者在整个疾病过程中保持在同一亚型中，但有13名（26.5%）非低纯度或PR亚型患者在基线时转变为进展时的PR亚型。

• 转变为PR亚型的患者迅速死于疾病，中位总生存期为88天，并且与也进展的其他患者相比，预后较差。

• 在PR和之前的非PR时间点比较基因功能状态时，9名转变为PR亚型的患者中有3名（33%）在进展时获得了完全的细胞周期依赖性激酶抑制剂丢失。

• 两名患者在进展时由于纯合子删除而完全丢失CDKN2C，一名患者在进展时获得了CDKN1B的完全丢失，并且仅在进展时检测到克隆性移码突变。