罗氏测序：士别10年，我胡汉三又回来了！

不下牌桌，就有希望。

这是巨头罗氏Roche在测序上的执念。

昨晚，罗氏以一次webinar，再次宣示了自己重返测序市场的决心。

01

454完美开局，黯然收场

聊到罗氏测序，就不得不聊起454 Life Sciences；

聊到454，就离不开测序大神Jonathan Rothberg。

（Rothberg相继创立454 Life Sciences、Ion Torrent、Quantum-Si，堪称测序常青树。）

1999年，Jonathan Rothberg创立454 Life Sciences（归属CuraGen公司）。

在人类基因组计划刚刚完成之际，2005年，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统： Genome Sequencer 20 System ，开创了边合成边测序之先河。

此时，罗氏是454公司的独家分销商。

454公司的GS测序仪在与Sanger测序的竞争中大放异彩，成为世界几大基因组中心的重要选择。

在那个“基因泡沫”的年代，或为巩固对454测序仪的未来使用权、或为以此开发诊断产品，复制罗氏PCR的辉煌，2007 年，罗氏与CuraGen公司签订协议，以1.55亿美元的现金和股票收购了 454 Life Sciences。

随后，在GS20技术基础上，罗氏454推出了性能更优的第二代基因组测序系统：Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。

这是Roche在测序领域的高光时刻。

但此时，一家名不见经传的创业公司，正在萌芽，它就是Solexa。

2006年，Solexa推出高通量基因测序系统Genome Analyzer，通量为1Gb/Run。

2007年，Solexa被Illumina收购。Illumina也借此迈入NGS测序领域，完成公司历史上最大的一次转变。

与Illumina测序仪相比，罗氏454尽管读长较长，但运行成本高、样本制备复杂，备受客户诟病。454系列在Illumina GAII、尤其是HiSeq2000发布后，迅速败下阵来。

（2008年GenomeWeb的调研，此时全球大型基因组中心中，Illumina测序仪的保有量，已经大幅领先。）

2013年，罗氏在竞争中，无奈宣布将逐渐关闭454业务、启动裁员。

2016年，454测序仪正式退出市场。

02

屡战屡败、屡败屡战

罗氏“测序之心”不死

如果说谁对测序是真爱，那当属罗氏无疑。

454露出颓势之际，罗氏并未原地等死，而是动作频频。

除基于454平台的常规升级外，其他行动主要有两块：

（1）押注纳米孔测序、（2）买买买。

2010年7月，罗氏454与 IBM 合作，宣布共同开发一种将使用 IBM DNA 晶体管技术的纳米孔测序仪。此时Roche估计，将这项技术商业化大约需要五年时间。（后终止）。

2010年10月，罗氏454 与总部位于英国的 DNA Electronics 公司，宣布合作开发一个低成本、高通量的 DNA 测序平台，该平台结合了 454 的测序化学技术及其合作伙伴的电化学检测技术。但当时并未给出商业化时间表。（2013年终止合作）。

2012年初，罗氏向 Illumina 提出了高达57亿美元的现金收购要约，意图将如日中天的Illumina纳入麾下。面对罗氏的敌意收购，Illumina 管理层迅速采取防御措施，宣布启动“毒丸计划”（股权摊薄反收购措施），最终阻止罗氏收购。

2013年，罗氏与 PacBio 达成了一项价值高达7500万美元的协议，宣称将利用PacBio的单分子实时测序技术开发用于临床诊断的检测方法。（2016年终止合作）

2014年，罗氏投资纳米孔测序企业 Stratos Genomics （SBX方法学拥有者），并与该公司达成了为期两年的研究合作。

同年，罗氏收购纳米孔测序公司 Genia Technologies （Nano-tag技术）。

2020年，罗氏与 Illumina 重归于好，达成临床市场相关的协议。

同年，罗氏宣布收购 Stratos Genomics ，以推进罗氏纳米孔测序仪的开发。

2024年中，罗氏声称纳米孔测序仪进展良好，但未给任何详细信息、时间表。

直至年初，罗氏正式释放最新纳米孔测序仪的相关信息，将结合Stratos Genomics SBX技术与Genia Technologies 高通量测序芯片，于2026年推出一款全新纳米孔测序仪。

罗氏测序的这一坎坷历程，建设兄下图有详细描述：

（图源：我是建设者）

03

这一次，罗氏带来了什么？

如上文所说，罗氏即将推出的纳米孔测序仪，结合了其收购的两家企业的优势：

Stratos Genomics SBX 技术 + Genia Technologies 高通量测序芯片 （高达800万 microwell array CMOS chip） 。

为什么罗氏没有使用类似ONT“纳米孔链测序”方案？

我们不妨先看看ONT“纳米孔链测序”技术路线的特点：

具体而言：在一张薄膜中嵌入若干纳米孔，并在孔的两端施加电压，使得带电的DNA/RNA单链在电场的作用下通过这些孔洞。当链穿孔一刻，离子电流产生阻断效应，引起电流的变化（特征阻断电流信号）。通过实时监测相应的变化图谱，并利用计算机辅助工具进行分析，从而实现核酸序列的测定。

这种测序方案，无需扩增、单分子直接测序、测序读长可达Mb级别，并且省去昂贵的光学信号捕捉系统，体积更小，对使用环境要求低。

然而，“纳米孔链测序”在技术实现过程中，发现以下难点：

（1）不同碱基的特征电流差异很小；

（2）每一组特征阻断电流信号，其实是由同时停留在纳米孔中的多个碱基共同贡献，而非单碱基信号，这也给后续碱基识别算法提出了极高的要求，尤其是对均聚物序列的判断；

（3）核酸单链过孔速度极快，和纳米孔相互作用的时间通常只有几微秒，过于短暂的信号持续时间让电子元件难以有效捕获。

“碱基间信号差异小、非单碱基信号、信号难以捕捉”，这都给纳米孔“链测序”准确率的提升造成非常大的挑战。

怎么解决碱基信号弱、过孔时碱基信号串扰的问题？

罗氏开发了一套全新的测序方法，即Sequencing by expansion (SBX) technology。

该测序技术路线如下：

具体可分为3步：

（1）使用具有 loop 结构的 X-NTPs：

SBX 技术使用一种特殊的核苷酸三磷酸（X-NTPs）。

与普通的 dNTPs 相比，X-NTPs 在碱基环和五碳糖连接的磷酸基团之间加入了一个 loop。 在酸催化下，这个结构可以展开、线性化 。除此以外，这个 loop 上还有区分不同碱基的 Reporter code 、用于稳定Xpandomer合成的增强子。

X-NTPs

（2）生成线性化的 Xpandomer ：

在 DNA 复制过程中，特殊的 DNA 聚合酶以 X-NTP 为底物，根据模板 DNA 的序列，依次将 ATCG 四种不同的 X-NTP 连接到 3' 端，生成一条聚合物。

DNA复制完成后，在酸的催化下，聚合物上的环可以展开，从而形成一条线性的分子，即 Xpandomer ；此时， Xpandomer 长度已是原来DNA长度的50倍。

（3）纳米孔测序：

线性的Xpandomer分子，随后以高效方式通过生物纳米孔。电压脉冲引导Xpandomer通过纳米孔，每次推进一个Reporter code，产生一个单独信号，从而进行碱基信号的识别。

这样的设计，带来几个显而易见的好处：

一方面， X-NTPs loop上的 Reporter code 大大提升了碱基信号；

另一方面，经过线性化处理的单分子聚合物，相邻碱基的物理距离被拉开，碱基信号间不容易发生串扰，更容易区分。

这样都带来了准确率的大幅提升。