生化免疫检验学底层原理系列（一）：HOOK效应

医学检验废品加工车间 · 公众号 · · 2024-05-29 14:48

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本期将开启一个新的系列—底层原理，计划通过讲解检验中某些现象的基础原理及其背后的逻辑。从而让大家深入了解其中的奥妙。话不多说，开始本系列的第一集—HOOK效应。

HOOK效应经常被大家遇到，其造成的异常结果非常令人头疼。一般情况下都是通过分析患者的病情并通过一些临床经验才能判断出样本是否受到HOOK效应的影响。那大家有没有想过，还有多少被忽略掉的受HOOK效应影响的异常样本结果？这些异常标本究竟是怎么产生HOOK效应的？本文就尝试着从分子层面对HOOK效应进行分析，也欢迎大家踊跃讨论。

HOOK效应与带效应

首先要说明的一点就是，目前大家经常将“带效应”和“HOOK效应”视为同一现象，从剂量反应曲线上来看，带效应中的后带线性和HOOK效应表现非常相似。但是仍有很多专家主张两者是有区别的，我也比较赞同二者区分开来，那究竟二者有什么样的区别呢？

带效应的本质是传统免疫血清学反应（例如沉淀反应、凝集反应等），是在完全的液相环境中自由运动进行的反应。这类反应主要是以观察目标沉淀物的存在以及量的大小来判断，例如常见的梅毒RPR实验。带效应可以大致用下图来表示。

前带效应是由于抗原、抗体比例不合适，抗体过量形成的不稳定复合物；而后带效应则是抗原过量形成的可溶性复合物。

而HOOK效应则是纯粹的抗原—抗体反应，而且是在液相和固相之间进行反应。无论是传统的ELISA还是现在的化学发光法，一抗要么在反应孔中，要么和磁珠连结。都会有固相的存在。而且HOOK效应没有等价带这一说，只有在检测高剂量的抗原时出现的高剂量钩状效应（High dose Hook effect，以下简称HD-HOOK），下面会针对HD-HOOK进行详细分析。

HD-HOOK分子原理

接下来我会对不同方法产生HD-HOOK现象的原因进行分析。此处用化学发光分析系统进行举例。夹心法的化学发光试剂中一般有两种重要试剂，第一种是含有抗体包被的磁珠试剂，我们称其为R1试剂；第二种则是发光物质或酶包被的抗体试剂，我们称其为R2试剂，这两种试剂与抗原结合才能形成抗原—抗体的“三明治”结构。有些试剂盒中含有3个甚至更多的组分，这些或是缓冲液或是阻断剂，在此暂时忽略，不予讨论。

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双抗夹心法—一步法

这种方法学是同时将R1试剂(Ab ₁ )、R2试剂(Ab ₂ )和样本(Ag)同时加入反应杯中进行反应，其反应平衡式如下：

其中明显可以看到是会有3种产物，分别是Ab ₁ •Ag•Ab ₂ 我们称其为X产物，Ab ₁ •Ag我们称其为Y产物，Ab ₂ •Ag我们称其为Z产物。正常情况下，由于R1试剂和R2试剂是足量乃至过量的存在，此时整体反应中，X产物会占据绝大多数甚至于全部，这也正是我们所希望的。此时的光信号和Ag是呈现一定的正比例关系。

但是当样本中的Ag过多时，会竞争性地结合Ab ₁ 和Ab ₂ _，导致Y、Z产物的增多，X产物难以形成，无法形成“三明治”结构。在最后的发光阶段中，由于X、Y产物均有磁珠存在，在多步清洗后仍会留在反应体系中，而Z产物则因为没有磁珠，会被洗脱出反应体系。但是Y产物又因为不含有发光物质，在发光阶段中并不发挥实际作用。这就导致了抗原明显多的情况下，反而光信号变弱，呈现一定的反比例关系。最后导致了假低值、假阴性的现象。

所以从理论上来说，一步法存在较高的HD-HOOK效应发生风险，应当在试剂说明书中明确标准HOOK效应发生浓度，以避免错误结果的发出。

其实一步夹心法在实验室中非常常见，其优点就是可以明显缩短反应过程中的孵育时间，加快实验进程。而且一步法操作也较为简便。多年之前的血筛四项ELISA试剂中就有一步法的试剂，但是由于担心有HOOK效应，会有漏检的风险，国家已经强制规定血筛四项ELISA试剂必须用两步法。

而在目前的实验室中，如果大家细心就会发现，进口的R司电化学试剂很多夹心法项目都是用的一步法，这也就是为什么人家能18分钟出结果的原因。是不是有些人还以为人家都是两步法，那是因为R司的R1试剂中抗体并不直接包被磁珠，而是抗体包被的生物素。其另一种试剂组分M试剂才是链霉素包被的磁珠，在后续的反应中，生物素和链霉素结合成为生物素—链霉素系统整体，进而形成夹心法的“三明治”结构。但是为什么平时几乎没有感受到R司的HOOK效应出现呢？这就是人家的先进之处了，据相关专利显示R司使用的抗体会进行一定的酶切、交联手段，使得抗体成为多聚体，然后再用分子筛筛选出所需分子量的多聚体抗体。这样就使得在同样的抗体浓度下，大大增加了可以和抗原结合的位点，减少了非特异性的结合，有效的延缓、降低HOOK效应的发生。这不是说R司的试剂不会出现HOOK现象，在抗原量足够大时，该发生HOOK效应还是会发生的。这一点在其说明书上会有具体标注。

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双抗夹心法—两步法

你们大概没想到吧？！

一直认为最可靠的两步夹心法也会出现HD-HOOK效应。如果单纯的从理论上来说，两步法是不存在HOOK效应的。因为当正常情况下，R1试剂(Ab ₁ )和Ag结合后，会经历第一次清洗。反应过程如下：

清洗后会剩下Ab ₁ •Ag复合物和 Ab _1，而 Ab ₁ •Ag复合物才会进一步与R2试剂(Ab ₂ )反应，从而生成Ab ₁ •Ag•Ab ₂ 的“三明治”结构。再经历第二次清洗，洗脱掉多余的R2试剂(Ab ₂ )成分。反应过程如下：

因为Ab ₁ 不含有发光物质，在发光阶段中并不发挥实际作用。最终的光信号结果和Ag是呈现正比例关系。

这其中即便是样本有过量的Ag存在，R1试剂(Ab ₁ )顶多会与Ag呈现饱和性的结合，在第一次清洗过程中多余的Ag也会被洗脱出反应体系，并不会在后续竞争性的结合R2试剂(Ab ₂ )。当有过量的Ag存在时，其剂量反应曲线顶多会呈现平台状延伸，并不会出现向下弯曲的反比现象。

但是在实践中部分实验室的确发现了两步夹心法的HOOK现象。具体表现就是稀释后的光信号比不稀释的还要高。对此学术界比较公认的解释就是蛋白质分子出现了构象变化，简称变构

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