近日，在陕西省人民医院心血管内一科王军奎主任的指导下，祝领教授课题组报道了通过表观遗传修饰转化将CD4+ T细胞诱导为Tregs，作为治疗动脉粥样硬化的新方法。研究表明，5-氮杂胞苷(Aza)能够在体外有效诱导初始CD4+ T细胞分化为功能性Tregs。同时，Aza 诱导的 Tregs 转移至小鼠后，可以显著抑制动脉粥样硬化的各个阶段。在 Aza-iTreg 转移后，ApoE−/−小鼠脾脏中的CD4+ T细胞出现了 Forkhead box P3(Foxp3) 调节性 T细胞特异性去甲基化区域(TSDR)的显著去甲基化以及 Foxp3 表达的上调。而这一过程，是 Aza 通过抑制 DNA 甲基转移酶 1(Dnmt1)介导的 Foxp3-TSDR 去甲基化和 Foxp3 表达的上调实现的。课题组的发现揭示了利用大量 Aza 将CD4+ T细胞诱导的 iTregs 进行细胞治疗在动脉粥样硬化的治疗中具有巨大潜力。该工作成果以“Epigenetic modification of CD4+ T cells into Tregs by 5-azacytidine as cellular therapeutic for atherosclerosis treatment”为题发表在国际知名期刊 Cell Death & Disease 杂志上。（点击文末“阅读原文”，即可下载原文PDF）
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，主要影响动脉血管壁，是全球心血管疾病的主要诱因之一。T细胞介导的免疫反应在动脉粥样硬化的发生中起着至关重要的作用，特别是 Th1、Th2 以及自然杀伤 T细胞的参与。大量实验研究一致表明，在小鼠和人类的动脉粥样硬化病变中，Th1细胞在CD4+ T细胞亚群中占主导地位。多个独立研究也证实，Th1驱动的免疫反应对动脉粥样硬化的发展有不利影响。调节性 T细胞(Tregs)作为 T细胞的一个重要亚群，能够通过抑制效应 T细胞的活性，维持免疫系统的平衡，并促进免疫耐受。Forkhead box P3(Foxp3)转录因子是 CD4+ CD25+ Tregs 形成和功能的关键调控因子。Tregs 在预防和减缓动脉粥样硬化的进程中发挥了重要作用，因此被认为是治疗该疾病的潜在手段之一。多项研究已经表明，外源性 Tregs 的输注可以抑制、逆转甚至预防动脉粥样硬化。然而， Tregs 在体内数量较少，仅占CD4+ T细胞的5%至10%。异体 Tregs 的输注可能引发免疫排斥反应，这限制了其临床应用的可行性。因此，尽管细胞疗法在治疗动脉粥样硬化方面具有潜力，获得足够数量的 Tregs 并避免免疫排斥仍然是一个重大的挑战。5-氮杂胞苷(Aza)是一种广为人知的 DNA 甲基转移酶(Dnmt)抑制剂。进入细胞后，Aza通过磷酸化形成5-氮杂胞苷-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，随后整合到 DNA 中，从而抑制 Dnmt 的活性。近年来，去甲基化药物在治疗多种疾病中的潜力备受关注。已有研究表明，Aza通过抑制 Foxp3 基因的甲基化，将效应 T细胞转化为 Tregs。我们此前的研究显示，动脉粥样硬化的进展与 Foxp3-TSDR(调节性 T 细胞特异性去甲基化区域)甲基化水平增加密切相关。然而，Aza在动脉粥样硬化治疗中的具体效果仍未明确。本研究的主要目标是在体外利用 Aza 诱导CD4+ T 细胞分化为 Tregs，随后通过静脉输注诱导的 Tregs(iTregs) 治疗动脉粥样硬化，并探索其潜在的机制。1. Aza-iTreg 减轻了 ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化
分离的 Tn细胞与 Aza(5μM)共同培养48小时后生成 Aza-iTreg，随后通过尾静脉注射至小鼠体内。注射前，使用台盼蓝染色检测细胞活力。与 Tn细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 在接受 WD 饮8周和12周的 ApoE−/−小鼠中显著减小了主动脉根部的病变面积(图1 A和B)。从 C57BL/6J 小鼠转移的正常 Tregs 在给予 WD 饮食8周后也明显减少了动脉粥样硬化病变的面积，并在12周后进一步减少(图1 A和B)。在病变面积的缩小方面， Aza-iTreg 转移与 Treg 转移之间没有显著差异(图1 A和B)。此外，我们评估了 Aza-iTreg 转移对小鼠全身主动脉病变的影响，结果显示 Aza-iTreg 转移显著减轻了全主动脉的病变负担。虽然在 WD 饮食8周后，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移对病变中的胶原含量没有影响，但两者在12周后都显著增加了病变中的胶原含量(图1 C和D)。同时，与 Tn细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移在 WD 饮食8周和12周后均显著减少了主 动脉根部病变中的巨噬细胞含量(图1 E和F)。在减轻巨噬细胞浸润方面，Aza-iTreg 转移与 Treg 转移之间无明显差异(图1 E和F)。这些结果表明，Aza-iTreg 转移有效缓解了动脉粥样硬化的加速发展，并有助于病变的稳定。
图1. Aza-iTreg 的静脉输注减少了 ApoE−/−小鼠的动脉粥样硬化
2. Aza-iTreg 增加了 Tregs 的比例并抑制了 ApoE−/−小鼠的炎症
在给予 WD 饮食8周后，与 Tn细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移均显著增加了ApoE−/−小鼠外周血中CD4+ Foxp3+细胞的比例，且这种增加在 Treg 转移组中尤为明显。同样，在 WD 饮食12周后，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移都显著提升了外周血中CD4+ Foxp3+细胞的比例。就外周血中 Tregs 的比例而言，Aza-iTreg 转移与 Treg 转移之间没有显著差异(图2 A和B)。通过免疫荧光技术，我们评估了主动脉根部病变中CD4+ Foxp3+细胞的含量。在WD饮食8周和12周后，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移均显著增加了主动脉根部病变中CD4+ Foxp3+细胞的含量，与 Tn细胞转移组和对照组相比(图2 C和D)。在增加主动脉根部病变中CD4+ Foxp3+细胞的效果上，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移之间没有明显差异。
此外，与 Tn细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移显著上调了 WD 饮食8周和12周后小鼠血浆中的 TGF-β(图2 E)和 IL-10(图2 F)水平。在血浆 TGF-β 和 IL-10浓度方面，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移之间没有显著差异(图2 E和F)。相反，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移显著降低了 WD 饮食8周和12周后小鼠血浆中 IL-1β(图2 G)和 IFN-γ(图2 H)的浓度，与 Tn细胞转移组和对照组相比。在抑制 IL-1β 和 IFN-γ方面， Aza-iTreg 转移与 Treg 转移之间也没有明显差异(图2 G和H)。
图2. Aza-iTreg 的静脉输注增加了 ApoE−/−小鼠中 Treg 的比例，并抑制了炎症因子的水平
3. Aza-iTreg 降低了 ApoE−/−小鼠脾脏CD4+ T细胞中 Foxp3-TSDR 的甲基化水平，并增强了 Foxp3 的表达从ApoE−/−小鼠的脾脏中分离CD4+ T细胞，使用CD4+ T细胞分离试剂盒通过磁性细胞分离法进行操作。在 Aza-iTreg 被动转移到 ApoE−/−小鼠体内后，接受 WD 饮食8周和12周的小鼠脾脏中的CD4+ T细胞表现出Dnmt家族成员(Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b)的 mRNA 和蛋白表达水平显著下降(图3 A–G)。Foxp3不仅是CD4+ CD25+ Tregs 的可靠标志物，还在其发育和功能中起到关键作用。因此，我们研究了 Aza-iTreg 转移对 Foxp3 mRNA 表达的影响。与 Tn 细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 转移显著降低了接受WD饮食8周和12周的小鼠CD4+ T细胞中 Foxp3-TSDR 的甲基化水平(图3 H和I)。Treg 转移在8周WD组的小鼠CD4+ T细胞中也同样降低了 Foxp3 的甲基化水平，与 Tn转移组和对照组相比有明显差异。同样，在 WD 饮食12周后，Treg 转移使CD4+ T细胞中 Foxp3-TSDR 的甲基化水平显著低于 Tn细胞转移组，但与对照组相比无明显差异(图3 H和I)。Aza-iTreg 转移后，CD4+ T细胞中 Foxp3 的甲基化水平与 Treg 转移组相似，甚至在 Aza-iTreg 转移组中更低。Aza-iTreg 转移和 Treg 转移均显著降低了 Foxp3-TSDR 的甲基化水平。这一甲基化水平的下降伴随着CD4+ T细胞中 Foxp3 mRNA(图3 J)和蛋白(图3 K和L)表达水平的明显上升。在 WD 饮食8周后，与 Tn细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移均显著提高了从 ApoE−/−小鼠脾脏中分离的CD4+ T细胞中 Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平。同样，在 WD 饮食12周后，与 Tn细胞转移组和对照组相比，Aza-iTreg 转移和 Treg 转移均显著上调了脾脏CD4+ T细胞中 Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平。Aza-iTreg 转移后，Foxp3 mRNA 和蛋白表达水平与 Treg 转移后的水平相当。这些结果表明，Aza-iTreg 转移后，ApoE−/−小鼠CD4+ T细胞中的 Foxp3-TSDR 去甲基化及其表达的增强得以显现。
图3. Aza-iTreg 的静脉输注降低了 ApoE−/−小鼠脾脏CD4+ T细胞中 Foxp3-TSDR 的甲基化水平和 Dnmt 的表达，同时增强了 Foxp3 的表达
4. Aza 通过 Dnmt1 介导的 Foxp3-TSDR 去甲基化和 Foxp3 表达上调将初始 CD4+ T细胞诱导为 Tregs
为探讨 Aza 如何诱导初始CD4+ T细胞分化为调节性 Tregs 的机制，我们从 C57BL/6J 小鼠的脾脏中分离了CD4+ T细胞，并对其进行 Aza 刺激。与未经处理的CD4+ T细胞相比， Aza 诱导后，Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b 的 mRNA 和蛋白表达水平显著降低(图4 A-C)。值得注意的是，Aza 处理组的 Dnmt 表达水平甚至低于CD4+ CD25+ T细胞组。为明确 Aza 抑制 Foxp3 甲基化的主要 Dnmt 靶点，我们进行了 ChIP 分析，评估了对照组CD4+ T细胞和 Aza 处理后的CD4+ T细胞在 Foxp3 位点 TSDR 区域的Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b 富集情况。结果显示，在对照组CD4+ T细胞中，Foxp3 位点的Dnmt1富集明显，而 Aza 诱导后 Dnmt1 富集显著减少(图4 D)。Aza 刺激后，Dnmt1 表达的下降与 Foxp3-TSDR 区域甲基化水平的显著减少相对应(图4 E和F)。Aza 处理组中 Foxp3-TSDR 的甲基化水平与CD4+ CD25+ T细胞组相当(图4 E和F)。同样，在 Aza 诱导及随后的 Foxp3 去甲基化过程中，Foxp3 的 mRNA 和蛋白表达水平显著增加，甚至超过了CD4+ CD25+ T细胞组的水平(图4 G-I)。此外，Aza 诱导后，CD4+ T细胞中 TGF-β 和 IL-10的浓度显著上升，而 IL-1β 和 IFN-γ的水平则显著下降。炎症因子的减少与 Foxp3 表达的增加密切相关。综上所述，研究结果表明，5-氮杂胞苷通过 Dnmt1 介导的 Foxp3 去甲基化及 Foxp3 表达的上调，成功诱导初始CD4+ T细胞分化为Tregs。
图4. Aza 通过介导 Dnmt1 对 Foxp3-TSDR 的去甲基化并上调 Foxp3 表达，诱导初始CD4+ T细胞分化为 Tregs
5. Dnmt1 的过表达减弱了 Aza 诱导的 Foxp3-TSDR 去甲基化和CD4+ T细胞中 Foxp3 的上调我们随后研究了是否通过腺病毒介导的 Dnmt1 过表达可以削弱CD4+ T细胞中 Foxp3 的表达。感染 AdDnmt1 的细胞显示出 Dnmt1 表达水平的显著上调。此外，Dnmt1 的过表达削弱了 Aza 诱导后 Dnmt1 表达的下降(图5 A–C)。与 Aza 诱导组相比，Dnmt1 过表达显著增加了 Foxp3-TSDR 的甲基化水平(图5 D和 E)，并抑制了 Foxp3 的表达(图5 F–H)。同时，Dnmt1 的增加显著降低了CD4+ T细胞中 TGF-β 和 IL-10的浓度，并显著提升了 IL-1β 和 IFN-γ的水平(图5 I–L)。此外，使用 Dnmt1 选择性抑制剂 GSK3685032 进一步证实，抑制 Dnmt1 可以促进CD4+ T细胞向 Tregs 分化。这些研究结果进一步证实，5-氮杂胞苷通过抑制 Dnmt1 诱导初始CD4+ T细胞向 Tregs 分化。
图5. Dnmt1 的过表达减弱了 Aza 诱导的 Foxp3-TSDR 去甲基化及 Foxp3 在CD4+ T细胞中的上调
目前关于 Aza 对动脉粥样硬化影响的研究还较为有限。我们的研究旨在探讨 Aza 是否能够在体外诱导初始CD4+ T细胞分化为 Tregs，并通过将这些诱导的 Tregs 转移至小鼠体内，抑制动脉粥样硬化的进展。此外，我们还试图揭示 Aza 促进初始CD4+ T细胞向 Tregs 分化的机制。研究结果表明，Aza 能够在体外有效诱导初始CD4+ T细胞分化为功能性 Tregs。同时，Aza 诱导的 Tregs 转移至小鼠后，可以显著抑制动脉粥样硬化的各个阶段。这一抑制效果主要是通过抑制 Dnmt1 实现的，抑制 Dnmt1 促进了 Foxp3 的去甲基化，并进而上调了 Foxp3 的表达(图 6)。这些结果表明，利用大量 Aza 诱导的 iTregs 进行细胞治疗在动脉粥样硬化的治疗中具有巨大潜力。
图6. Aza 在动脉粥样硬化治疗中的作用机制示意图
参考文献
1. Ling Zhu, Zhongwei Liu, Qianwei Cui, Gongchang Guan, Rutai Hui, Xiqiang Wang, Junkui Wang, Yong Zhang, Xu Zhu. Epigenetic modification of CD4+ T cells into Tregs by 5- azacytidine as cellular therapeutic for atherosclerosis treatment [J]. Cell Death and Disease 2024, 15:689.
祝领陕西省人民医院心血管内一科，副主任医师，临床医学博士，硕士生研究生导师。毕业于西安交通大学心血管内科，从事心血管内科临床及基础研究工作。擅长复杂冠心病介入治疗、肥厚型心肌病介入治疗、肺栓塞介入治疗。在冠心病、心肌病、肺血管疾病、心力衰竭、高血压、心律失常等心血管内科常见疾病的诊治工作方面具有丰富的临床经验。主持多项国家及省部级基金，主持国家自然科学基金 1 项，省部级基金 9 项。陕西省卫健委“青年人才”项目获得者。担任《Cardiology plus》、《Cardiovascular Innovations and Applications》杂志编委。以第一作者或通讯作者在 Hypertension、 Cell Death & Disease、 Can J Cardiol、 J Am Heart Assoc、Atherosclerosis 等杂志发表 SCI 论文 24 篇。发表 ACC、 AHA 等国际会议摘要 16 篇。参编专著 4 部。
张勇陕西省人民医院心血管内一科，主任医师，医学博士，科室业务副主任。毕业于西安交通大学医学院。国际认证 ADR 带教术者(ADR Proctor)，陕西省国际医学交流促进会心血管专业委员会常务委员，西安市医学会胸痛专业委员会常务委员，陕西省保健协会高血压专业委员会常务委员，中国心胸血管麻醉学会基层心血管病分会常务委员，陕西省医学会心血管内科分会青年委员，中国医师协会高血压专业委员会委员，西安医学会心血管病学分会委员，陕西省医师协会心力衰竭专业委员会委员，《中华高血压杂志》中青年编委。熟悉大内科业务，精于心血管专业，具有丰富的临床经验，擅长复杂高危冠心病介入诊断及治疗手术，在冠脉分叉病变介入治疗、左主干病变介入治疗、高危复杂病变 CHIP 介入治疗、冠脉慢性闭塞性病变 CTO 介入治疗方面积累了丰富的临床经验，熟练掌握正向导丝技术、逆向导丝技术及 ADR 技术，CTO 开通率在95%以上；熟练掌握 IABP 及 ECMO 心脏辅助器械治疗、冠状动脉钙化旋磨术、激光消融术、冠脉生理学检查 FFR 测压、腔内影像学 IVUS、OCT 在冠脉优化治疗中的应用及多种冠脉辅助器械的应用；熟悉永久性心脏起搏器及 CRT-D 植入术、经皮导管射频消融术、先天性心脏病封堵术。主持陕西省自然科学基金面上项目 2 项、陕西省人民医院拔尖人才项目支持基金 1 项、陕西省人民医院学科建设高质量发展首批项目 1 项，参与国家高技术研究发展计划(863 计划) 1 项、国家自然科学基金 2 项、省部级科研基金 2 项；以第一或通讯作者发表包括 Nature Communications、Cell Death and Disease 论文 30 篇，其中 SCI 索引论文 20 篇；获陕西省科学技术进步二等奖 1 项、陕西省自然科学二等奖 1 项；主编专著 1 部，主译专著 1 部，参编专著 1 部，参与制订“正向夹层再入真腔技术在冠状动脉慢性完全闭塞病变介入治疗中应用中国专家共识”。
王西强陕西省人民医院心血管内一科主治医师，西北大学博士后，美国华盛顿大学与西安交通大学联合培养博士。主持中国博士后基金面上项目、陕西省自然科学基金青年基金等 7 项，以第一作者发表 SCI 文章 14 篇。
祝绪江苏省人民医院心血管内科，临床医学博士，南京医科大学博士后，主治医师，南京医科大学内科学讲师。毕业于南京医科大学心血管内科，主要从事心血管疾病的基础及流行病学研究，参与国家自然科学基金面上、国家科技部十二五课题及国家科技部十三五课题各一项。国内外杂志共发表学术论文 30 余篇，其中以第一作者或通讯作者在《Journal of the American Heart Association》、《Hypertension Research》、《Diabetes, Obesity and Metabolism》、《Environmental Research》等杂志发表 10 篇论著型 SCI 论文。
王军奎陕西省人民医院心血管病院副院长，心血管内一科主任，医学博士、主任医师，教授，硕士研究生导师。中国医师协会高血压分会委员，中国医师协会心力衰竭分会委员，国家心力衰竭专家委员会委员、陕西省心血管病学会常委、陕西省心脏起博与心脏电生理学会常委，主要从事于冠心病，心律失常的介入治疗，近年来带领团队连续获得了多项国家自然科学基金资助，在代谢综合症的基础及临床方面进行了持续深入的研究。本文内容为《门诊》杂志原创内容
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