三维重组皮肤模型在体外替代遗传毒性评价中的应用

遗传毒性是重要的毒理学终点，可对药物的致突变性及致癌性提供早期预测。随着国际社会对实验动物福利伦理和动物实验 3R 原则（ reduction ， replacement ， refinement ）日益重视，各国相继加入发展体外替代模型的行列。尽管人用药品注册技术要求国际协调会议（ ICH ） S2 （ R1 ）中提高了体内动物实验在结果决策中的权重，在标准评价组合中体外实验仍占据重要位置。然而，体外试验系统与人体组织相比，在受试物靶组织作用浓度、代谢等方面存在较大差异。仅基于现有体外遗传毒性实验模型的评价结果的特异性和灵敏性受到了质疑。如 Kirkland 等 ^{［ 1 ］} 报道肿瘤抑制蛋白 p53 的缺乏是各体外细胞遗传毒性实验产生假阳性结果的基础，而常用细胞中除人淋巴细胞外都不具有功能性 p53 ，导致目前基于常用哺乳动物细胞（ CHL 、 CHO 、 V79 等）的体外细胞遗传实验的假阳性率较高。此外，一些在体外哺乳动物微核试验及染色体畸变实验中检测结果为阳性化学物质，在相同检测终点的体内实验中发现并不具有遗传毒性或致癌性；如，芳香胺类物质易于在体外研究中得到假阳性结果 ^{［ 2 ］} ，其原因与体外实验系统缺乏体内代谢补偿机制有关，具有氧化作用机制的化合物在体外评价体系中容易产生假阳性结果。 Greenwood 等 ^{［ 3 ］} 提出细胞毒性是造成体外细胞致裂性试验假阳性结果的另一主要因素，且高浓度检测被认为是导致体外细胞遗传实验假阳性的重要来源。尽管 ICH S2 （ R1 ）已经降低了体外细胞实验的最高浓度要求，但是这些体外细胞实验无法提供毒代动力学数据。与此同时，体内实验方法也存在一些短板。如体内遗传毒性实验通常以骨髓或外周血为检测对象，并对上述组织中的遗传毒性生物标志物的变化进行评估。放射影像剂、抗酸铝合剂、某些吸入用药、皮肤或其他局部用药在骨髓或外周血中的暴露量很低，在传统体内遗传毒性中很可能得到假阴性结果。以皮肤外用药物为例，其体内吸收和全身分布较少。如对苯二胺人体经皮吸收率仅为 0.18% ，试验应用的受试物浓度远高于实际应用的浓度，与人体没有很好的生物相关性，无法预测受试物靶器官的遗传毒性 ^{［ 4 ］} 。当改变给药途径也无法提供足够的靶组织暴露时，或在暴露水平较高的组织无法取材进行遗传毒性评价的情况下，可考虑仅开展体外实验。目前的体外遗传毒性实验研究重点在于如何提高体外遗传毒性实验的准确性，并找到更加合适且有效的体外替代模型进行遗传毒性评价。

皮肤是阻挡化学物质的有效屏障且具有一定代谢活性。伴随替代毒理学的兴起和组织工程技术在毒理学中的大量应用，三维（ 3 dimensions ， 3D ）重组人工皮肤模型已成为体外毒性评价中的热点。 3D 重组皮肤模型使用人来源的皮肤组织构建，试验结果与人体毒性结果比较更具可比性和针对性，且符合动物伦理 3R 原则，试验周期短，日益受到企业与科研机构的关注。当前已有商品化的皮肤模型，如 EpiDerm ^TM 等，已被用于体外微核试验及彗星试验。本文将综述人 3D 重组皮肤模型在遗传毒性评价中的研究进展，探讨其作为新型体外遗传毒性替代模型的发展状况及其在药物安全性评价领域的应用前景。

1 3D 重组人工皮肤模型

皮肤作为人类最大的器官，包含多种类型的细胞，这些细胞相互影响，协同作用，构成阻挡有害物质进入机体的第一道天然屏障。体外皮肤模型的研发的初衷是解决临床患者大面积皮肤损伤与缺失修复的难题。首个表皮模型于 20 世纪 70 年代成功构建，自 90 年代开始应用于体外化妆品安全性评价 ^{［ 5 ］} 。 3D 重组人工皮肤模型是将人健康皮肤细胞培养于特殊的插入式培养皿后而得到多层立体培养的皮肤组织模型，可从功能和结构上高度模拟人体皮肤，预计具有正常的 DNA 修复和细胞周期控制功能，与目前在标准体外遗传毒性试验中使用的体外哺乳动物细胞代谢酶相比，其代谢能力与人体代谢更为接近，在毒性评价中具有重要价值 ^{［ 6 ］} 。与此同时，体外人工皮肤模型可以考察皮肤吸收与毒性效应之间的关联，可通过制备皮肤组织切片并对代谢产物进行分析，对受试物安全性提供更多指标的信息。

皮肤模型多由人初代细胞构成，经验证其在基因表达、组织结构、细胞活性、细胞因子分泌等方面与人体皮肤均达到高度一致 ^{［ 7 ］} 。以 SkinEthic ^TM 3D 全厚皮模型为例，其与健康人面部皮肤有一定的组织相似性 ^{［ 8 ］} 。然而，因当前 3D 重组皮肤模型尚不包含毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属结构，在组织结构和功能上存在缺陷，部分特异性标志物存在异常表达，且模型中的皮肤屏障功能低于真实皮肤， 3D 模型试验中的经皮吸收率通常高于真实人群使用情况，且商业化模型供应商有限、售价较高限制其推广应用 ^{［ 9 ］} 。进一步研发与人体接近的、适合不同类产品评价需求的、稳定的、可长期重复给药的皮肤模型将是今后研发的重点。

在商品化模型中， EpiSkin ^TM 、 ZEBET 的 EpiDerm ^TM 和 Skin Ethic ^TM 分别于 1998 年、 2000 年和 2006 年通过实验室间联合验证证实其可根据 OECD TG 431 有效检出腐蚀性和非腐蚀性化合物，上述模型可作为皮肤腐蚀性检测的动物试验替代方法。欧洲替代方法验证中心（ European Centre for the Validation of Alternative Methods ， ECVAM ） 2007 年宣布 EpiSkin ^TM 可作为 Draize 皮肤刺激试验使用的替代模型。当前正在开展遗传毒性试验研究的皮肤模型分别为 EpiDerm ^TM 和 EpiSkin ^TM ，两者特性见表 1 ，其中表皮模型主要用于微核试验，而全皮模型则更适用于灵敏度较高的彗星试验 ^{［ 10 ］} 。且有研究报道，在 EpiSkin ^TM 和 EpiDerm ^TM 中有类似人皮肤的外源性代谢基因表达 ^{［ 11-12 ］} ，且芳香胺、对苯二胺和对氨基苯酚能通过 N - 乙酰化以类似于人皮肤的方式被代谢。

2 体外替代遗传毒性试验

体外替代遗传毒性试验已被证实可作为检出体内的基因毒性物质和啮齿类致癌物的手段之一。因涉及遗传毒性的机制的多样性，单一的体外遗传毒性试验结果并不可靠，欧盟消费者安全科学委员（ SCCS ）推荐使用一组体外遗传毒性试验来鉴别化合物的遗传毒性风险。然而由于高细胞毒性或继发性的遗传毒性作用等因素，现有的体外遗传毒性试验组合特异性较低，且有较高的假阳性率。对于膏药状的、性状黏稠的外用药物， 3D 皮肤模型比二维（ 2D ）细胞模型在给药方法上可以更好地模拟实际情况。为解决高假阳性率的问题，下述 3 个项目亟待推动：优化出现假阳性的体外哺乳动物细胞的试验方法；选择更多相关细胞和更敏感的毒性试验方法；开发 “3D 皮肤模型 ” 项目，验证结合微核和彗星分析的人类重建皮肤（ reconstructedskin ， RS ）模型的应用 ^{［ 13 ］} 。

2.1 微核试验

微核（ micronucleus ， MN ）是一种独立于主核之外的核小体，存在于细胞质中，其形成与基因组的不稳定性和染色体的损伤有关。微核试验作为一种快速、简便、经济的基因毒性检测方法，已成为遗传毒性检测的常规检测手段。欧洲化妆品协会（ European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association ， COLIPA ）组织欧盟、美国及日本多家实验室开展基于 EpiDerm ^TM 的国际实验室间联合验证，通过试验方法标准化、已知毒性受试物小范围验证（首先由美国宝洁公司、美国体外科学研究院及 MatTek 3 家实验室分别对丝裂霉素 C 和硫酸长春碱进行评价，之后在德国汉高公司和法国欧莱雅公司再次对试验结果的可重复性和可转移性进行验证）和大量受试物实验室间联合验证逐步确认试验方法及其复现性 ^{［ 14 ］} 。当前已完成 29 个受试物的大规模验证，结果发现 EpiDerm ^TM 的特异性达到 88.1% ，灵敏性达 62.5% ，而一致性达到 81% ^{［ 15 ］} 。 Yuki 等 ^{［ 16 ］} 比较 EpiDerm ^TM 和正常人表皮角化细胞对多种已知体内非遗传毒性及遗传毒性化合物的试验结果，发现受试物不经 S ⁹ 作用即可得到接近体内的研究结果，与此同时 EpiDerm ^TM 也可较好地排除因毒性引起的体外培养细胞假阳性结果。 Hu 等 ^{［ 17 ］} 使用 EpiDerm ^TM 对包括代谢激活的促突变剂和 DNA 交联剂等 8 种化合物开展验证并指出该模型可实现接近体内研究的暴露条件，有效对染色体损伤风险作出预测。人工合成的纳米颗粒与血清蛋白结合后其体内毒代动力学特征发生严重改变，因此 Wills 等 ^{［ 18 ］} 使用 3D 皮肤模型 EpiDerm ^TM 对人工合成纳米颗粒进行了在体外微核试验基础上的遗传毒性评估，有助于对体内 - 体外结果的差异进行解读。该课题组成功开发了 3D“ 纳米 - 重组皮肤微核试验 ” 的方法，研究结果提示 3D 体外皮肤模型可能在弥合纳米毒理学中体外和体内结果之间的差距中发挥重要作用。

近年来， EpiSkin ^TM 皮肤模型也陆续开展微核试验的验证工作，一项就 17 种化合物的胞质分裂阻断法微核试验研究发现其用于评估化合物遗传毒性的特异性、准确性及一致性分别达到 60% ～ 75% 、 83% ～ 85% 和 76% ～ 82% ，且 72 h 长时间暴露于受试物的方式可有效提高遗传毒性物质的检出率 ^{［ 19 ］} 。中国 EpiSkin ^TM 皮肤模型微核试验方法已于我国完成初步验证 ^{［ 20 ］} ，结果显示该模型的稳定性和细胞增殖活力可满足试验需求，并可将阳性物质长春新碱、 N - 乙基 - N - 亚硝基脲、 3- 丁内酯、 2- 乙酰氨基芴（ 2-AAF ）和阴性物质环己酮、 2 ， 4- 二氯苯酚的遗传毒性进行归类，证明其具备一定预测能力。由于人表皮不仅具备屏障功能，同时也是具备代谢能力的器官，受试物必须通过皮肤酶的代谢才能表现出遗传毒性，在上述 6 种物质初步验证的基础上， Chen 等 ^{［ 21 ］} 使用需要通过代谢激活才能显现出遗传毒性的物质 2-AAF 证明了 EpiSkin ^TM 的代谢活性，提示未来研究中还需验证其他经代谢活化的遗传毒性物质。

2.2 彗星试验

3D 皮肤彗星试验的原理是断裂后的 DNA 片段通过琼脂糖凝胶电泳进行迁移，从而形成完整的 DNA“ 头部 ” 及片段化的 DNA“ 尾巴 ” ，用结合了 DNA 的荧光剂染色后通过荧光显微镜对单个细胞进行分析，并将彗星尾巴中的 DNA 占比作为 DNA 损伤的量度。 3D 皮肤彗星试验能够同时检测可能引起基因突变的染色体损伤和 DNA 损伤，从而补充了仅检测染色体损伤的重组皮肤微核试验。且彗星试验因不依赖增殖细胞，能用于研究可进行单细胞分离的细胞培养或组织中的 DNA 损伤，更适合应用于皮肤组织。

目前 3D 皮肤彗星试验被应用于 EpiDerm ^TM 和 Phenion ^® 两个重组全皮人皮肤模型中，特定组织的单个细胞分离试验及常规彗星试验已被转移至欧洲和美国的实验室，试验建立后，试验方案使用适当的细胞毒测定方法和 DNA 修复抑制剂阿非迪霉素提高该方法的敏感性。 Reisinger 等 ^{［ 22 ］} 使用 EpiDerm ^TM 陆续开展分阶段的体外彗星试验实验室间联合验证工作。在第 1 阶段和第 2 验证的工作中分别使用甲磺酸甲酯、 4- 硝基喹啉、乙酰基亚硝基脲、 2 ， 4- 二氨基甲苯、硝基苯酚、环己酮等对模型进行验证，发现该模型的复现性较好。然而溶剂组背景值过高（高于 30% ）成为进一步大规模验证的瓶颈。

也有研究提示尚未发育完全的细胞模型要提前 4 d 运输，然后在进行测试的实验室中进一步培养，使用不发达的 EPI-201 可减少运输时长对皮肤模型质量的影响，从而降低背景值 ^{［ 23 ］} 。 Reus 等 ^{［ 23 ］} 基于 3D 皮肤模型微核试验的方法，在 EpiDerm ^TM 皮肤模型上对彗星试验进行了优化，并通过 3 家实验室验证了在 EpiDerm ^TM 皮肤模型上通过皮肤暴露途径对化合物进行彗星试验分析的可行性。 Kaluzhny 等 ^{［ 24 ］} 使用 MatTek 高度分化的 EpiDerm ^TM 皮肤模型开展了重组皮肤模型的微核和彗星试验，并成功验证了遗传毒性物质的作用。化妆品欧洲遗传毒性专项组（ Cosmetics Europe Genotoxicity Task Force ）和德国联邦教育与研究部正在使用全皮模型如 EpiDerm FT 或 Phenion ^® FT 研究使用其开展彗星试验的重复性和预测效力 ^{［ 23 ］} 。在 Reisinger 等 ^{［ 22 ］} 进行的验证研究中，第 1 阶段中 3 个实验室均使用丝裂霉素 C 、氯化镉、 N - 乙基 - N - 硝基脲、 7 ， 12- 二甲基苯并蒽、没食子酸丙酯、丁香酚、邻苯二甲酸二（ 2- 乙基己基）酯、环己酮等 8 种化学品在 Phenion ^® 全层皮肤模型上进行验证，最终 3D 皮肤彗星测定法显示出较高的预测能力以及良好的实验室内和实验室间可重复性， 4 个实验室达到了 100% 的可预测性，第 5 个实验室达到了 70% 的可预测性。

3 在药物体外替代遗传毒性评价中的应用

基于 3D 重组皮肤模型的体外替代遗传毒性评价方法的开发始于 2006 年启动的国际验证工作，从最初在 EpiDerm ^TM 上对遗传毒性阳性剂丝裂霉素 C 及硫酸长春碱完成了体外替代遗传毒性评价的可重复性及可转移性验证，到后来陆续进行对市售模型 EpiDermFT ^TM 及 PhenionFT ^® 的验证。使用 EpiDerm ™ 皮肤模型对体外微核试验进行的多年验证工作已经完成；同时，使用 3D 重组皮肤模型对体外彗星试验的验证工作的前两个阶段也已完成，其数据表明 3D 皮肤体外彗星试验可作为 Ames 试验阳性结果的追踪试验。基于在东京举办的遗传毒性测试研讨会（ IWGT ）上提出的多年国际验证工作数据， 3D 重组皮肤模型的体外微核及彗星试验在实验室内和实验室间具有良好的可重复性， 56 种编码化学品的验证已经证明二者的组合试验可预测体内预期的遗传毒性，工作组认为现在已经充分验证了 3D 皮肤微核和彗星试验，可以朝着制定单独的 OECD 测试指南的方向发展 ^［