我的引物设计的老有非特异性扩增怎么办？

如果你是一个合格的菜鸟，那肯定遇到过这样的情况：

嗯，没错，就是跑电泳把单一片段跑成了Marker，或者做qPCR，发现峰峰相连到天边。这就是非特异性扩增。这就是为什么，我们需要在设计引物后，要把引物进行Primer BLAST的原因。

就给你举一个栗子，比如，这个是P53的基因组的序列，我随便弄了一段来设计引物：

这个软件是最简单的引物设计了，就只管Tm值，别的啥都不管，要是想要这个就回复“AnnHyb”就有了。好吧，我就随便设计了一下引物。

然后就把我要分析的这对引物，bia到Primer BLAST上去，嗯，这是个NCBI的网站：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

这个原理就跟BLAST差不多，就是比对出和你引物差不多的序列来，看看有没有非特异性扩增。

拉到下面，会有一个非特异扩增范围的选择，比如选择物种，既然我们是做人P53的，那就选人，也就是看，这对引物能不能在人类的基因组里扩增出别的片段来。Database主要是看你扩增的是RNA还是基因组DNA之类的，这个自己选就好。

结果中，你可以看得到，我们需要扩增的片段，是375bp，非特异性扩增的片段也会显示出来，有1002bp，而且在正反向引物上，就四个碱基的差异，说明这对引物不好用。

是不是觉得除了这个就没啥用？其实并不是，还有一种就是混合样本的检测，比如你扩增粪便中某个肠道菌群的基因，那就麻烦了，因为里面东西比较杂，所以要排除一些主要的微生物中的非特异性扩增，比如我设计一个大肠杆菌的：

引物bia进去之后，就要选择有可能存在的别的物种，既然是肠道菌群，那就有可能有人的基因，还有肠道其他细菌真菌的，就添加物种范围就行了。

呃，结果发现，这段序列特异性居然非常好。

好吧……

李莫愁博士：当然这个PrimerBLAST在引物设计的过程中是非常有用的，主要可以降低你非特异性扩增的概率，一旦出现非特异性扩增的可能性，就应该及时更换引物，或者采取提高退火温度等措施了。好了，今天就先策到这里吧。