从细胞生物学的角度上说，微环境是指在特定空间中，细胞及其周围的非细胞成分（如细胞外基质、信号分子、代谢产物等）共同构成的局部环境。这些组分通过动态的相互作用，调节细胞的功能和行为。
可以看出，微环境本质上是空间层面的研究。
对微环境进行的高分辨率研究通常需要单细胞转录组辅以免疫荧光、免疫组化等实验方法。如今随着空间技术的发展，我们不仅可以获得微环境中的细胞转录图谱信息，还能获得转录本的空间位置信息从而以多维角度解析微环境中的生物学信息。
空间转录组的微环境研究的主要目标是解析组织内的复杂环境，因此在研究样本的采集过程中，我们通常从空间维度出发，从宏观和微观的角度确定样本的采集策略。
从宏观的角度来看，样本的采集需要重点关注采样位置。关于采样位置的选择，微环境研究往往更倾向于复杂环境中的关键区域，例如病灶与正常组织的过渡区域，炎症反应的活跃区域，或者组织修复正在发生的部位。这些区域通常包含多种细胞类型，并且细胞之间的互作较为频繁，具有这类特征的样本数据通常可以提供可观的生物学特征信息。例如：在前列腺癌研究中，可以对含有不同阶段基底细胞癌的组织进行取样
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。胰腺癌研究中也会同时选择原发病灶、转移灶和癌旁组织进行分析
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。这种实验设计的显著优势在于能够同时挖掘共性与特性：
共性所展现的是不同样本间存在的共通的生物学规律。例如，在胰腺癌微环境研究中，内皮细胞和血管周围样成纤维细胞的共存反映了脉管系统相关细胞类型之间的相互依赖性。
特性所突出的是不同状态或分组的样本中观察到的特定现象。例如，在前列腺癌研究中，前列腺基底细胞癌中的SFRP4的表达要显著高于非基底细胞癌组织
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。
对共性以及特性展开的系统性探究与分析，能够给研究目标提供更为完备、全面的科学解释，同时也能为疾病的诊断及治疗提供坚实可靠的理论依据。
图一：不同阶段前列腺基底细胞癌的组织切片特征
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从微观的角度来看，可以通过组织学分析筛选目标样本，实现对样本区域的精准采集。组织学以及病理学作为传统的“空间”解读工具，能够以更精确方式剖析样本特征。在空间转录组学研究中，这种传统的空间技术也常常用于确定样本的具体生理状态，例如识别肿瘤的浸润边缘或坏死区域等，均需要依赖组织学分析的支持。组织学分析的关键在于揭示组织微环境的多样性。例如，在肿瘤组织中，肿瘤核心区域往往存在氧气和营养匮乏的特点，细胞多样性可能较低，而在肿瘤边缘或浸润区域，可能聚集了多种免疫细胞、成纤维细胞、基质细胞及其他细胞类型，这些区域的细胞互作复杂且活跃，是探索肿瘤微环境的样本。
微环境空间转录组研究分析的难点主要体现在：1、细胞组成多样性；2、基因互作网络的复杂性。进行微环境的分析需要将二者提供的信息进行结合来解释在微环境中各细胞之间的互作情况。这也为数据分析的主要方向提供了指引，即以定位分析为基础，构建空间图谱以全面展现细胞与基因的空间分布特征，同时辅以定量分析和多组学整合，深入探索细胞与细胞之间、基因与基因之间的调控关系及其网络结构。
我们首先来看多组学关联分析。目前空间转录组的多组学关联的研究主要是与单细胞转录组进行关联的策略，这一策略能从两个角度解析数据：（1）细胞空间图谱的构建，这是定位分析的核心基础内容，通过单细胞转录组去卷积方法可以一定程度上在空间转录组数据中还原出更加精细的空间细胞图谱；（2）细胞层面的网络解析，高分辨率的转录图谱信息是单细胞转录组的显著优势，例如基于SCENIC和WGCNA的基因调控网络构建，以及基于细胞互作分析的细胞网络构建。这些方法能够减少空间转录组数据分辨率不足的影响。然而，细胞互作分析中常伴随一定程度的假阳性问题，这主要源于单细胞转录组仅基于表达量信息，缺乏空间位置信息的考量，这也正是进行空间转录组分析的意义所在。
图四：空间多组学关联可以从空间和细胞层面上挖掘更可信的关键基因
在此基础上，我们可以通过定量分析进一步确定网络关系。与单细胞转录组不同，空间转录组提供的网络关系更强调空间特性。而空间亚群通常是基于前期实验中的解剖学特征和spot的空间位置信息定义的，因此后续的网络关系能够很好地解释基因与spot在空间分布上的关联性。在进行细胞互作分析时，通常需要选择相邻的区域进行研究，这使得所识别的配体-受体关系能够更合理地反映空间层面的生物学现象。此外，通过定量分析得到的结果，还可与单细胞转录组数据整合，进一步筛选出范围更小、互作关系更明确的基因群体。
最后，通过定位分析完成对结果的最终筛选。具体而言，我们通过共定位分析识别在空间上重叠的基因与基因，以推断基因调控关系；识别细胞与细胞，以可视化其互作模式；以及识别细胞与基因，以确定空间微环境中重要特征的基因。定位分析相对具有一定的主观性，研究者主要依赖对可视化结果的解读。然而，这部分分析基于定量分析的初步结果展开，并通过两项重要标准进行筛选：（1）位置特征，这是最基础的筛选标准，空间分布的一致性是构建有效调控网络的必要条件；（2）功能特征，基因和细胞功能需与相应表型直接对应，以支持分子机制的合理解释。
图五：通过胰腺癌细胞-免疫细胞共定位进行基因共定位筛选
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微环境解析的核心挑战在于空间特性与基因网络相互叠加所带来的复杂性。这种复杂性也是多种组织表型背后的重要分子机制基础，例如肿瘤的迁移、胚胎发育的定向调控以及免疫发生中心的免疫成熟等。在这些特定环境中，细胞类型的多样性与基因网络的复杂性相辅相成。空间转录组技术的应用，为高通量的基因挖掘提供了更为强大的工具，能够推动我们对微环境本质的理解。
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