细胞冻存与复苏的前世今生

细胞冻存步骤：

细胞复苏步骤：

常见注意事项：

1. 有关DMSO的一些注意事项：

   
   

• DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。

• DMSO在溶解过程中会放热，应先与培养基混匀后再加血清，同时冻存液最好提前配置，DMSO现配对细胞的毒性可能更大；

• 复苏时，要离心去除DMSO，并用新鲜的培养基洗涤1-2次，注意离心的时候速度不要太快；

2. 血清需要比正常养细胞时多加，一般为10%-20%。

3. 解冻时，要尽快将冻存管整体温度上升至37摄氏度，由于冻存管具有一定的厚度，故而可以将水浴锅的温度调至40摄氏度左右，可以缩短解冻时间。

4. 梯度冻存，即可以按照-4℃-->20℃~40℃-->80℃-->液氮的顺序程序性降温。

知识点思维扩散：

　　1972年，冷冻损伤的两因素假说：冰晶损伤和溶液损伤假说被Mazur等人首先提出，他们是根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析得到的。

　　冰晶损伤假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

　　溶液损伤解说认为随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。

（来源：解螺旋 2014-12-24）

细胞冻存与复苏的血泪教训

解螺旋.毛博

很多时候，我们需要把细胞冷冻起来，以便于长期保存，以备不时之需。而复苏，就是使冷冻的细胞苏醒过来，恢复活力。

其实，细胞冻存和复苏的protocol教科书和实验手册上面都有。毛博我不想再重复了。这里，毛博根据自己做细胞培养近10年的经验和体会，谈谈应该注意的一些事项和技巧，大部分都是血泪教训和经验总结。都是干货哟。

1冷冻越慢越好，复苏越快越好

高大上的实验室可以使用程序冷冻仪。一切由机器代劳。屌丝实验室就只好用人肉程序冷冻仪。具体的protocol，到处都有。毛博想提醒大家的是，细胞冷冻越慢越好，宁慢勿快。做细胞冷冻前，事先留出充足的时间。

而复苏速度越快越好。从液氮罐里取出来之后，迅速放在37°C水浴中，然后使劲摇呀摇。令其尽快融化。

2高高兴兴上班，平平安安回家

细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出事的部分。凡是和液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。最需要小心的是：复苏的时候，在水浴中摇呀摇的时候。有时候小瓶会爆炸的。所以，一定要戴保护眼镜和手套。不多说了，说多了满眼都是泪。还有，冻存液中的DMSO是有毒致癌的。接触的时候一定一定要带好手套。

3冻存细胞数量要足够

无论再怎么小心，细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以，一开始冻存细胞的数量要足够。一般最低要达到5×10⁶/毫升，一瓶不够两瓶凑。但是，这个不能一概而论。有些细胞，比如杂交瘤细胞，只需要1-3x10⁶/毫升。

4做好标记

把培养瓶放入提手，末端应该扎有小牌，注明主人的名字，细胞名称和冻存日期。还要在每个冻存管上写上细胞名称，代数和冻存日期。

实验室的液氮罐都是公用的。每个人应该有属于自己的提手。毛博当年就发生过为了找自己的细胞，被迫把整个液氮罐翻了个底朝天的惨剧。

5细心呵护

刚刚复苏的细胞就象刚刚出生的baby，非常脆弱。需要我们的细心呵护。培养液要事先在培养箱或者水浴中复温。一切的和细胞接触的动作都要轻柔。把细胞从冻存管里吸出来，注入离心管，要轻轻地吸取和滴加。包括给离心管补加培养液的时候，都要轻轻地滴加。离心要用低速离心（500-1000转/分钟）。吹打要用专用的吹打管，而不要图方便用移液枪，吹打也要轻轻的。

6DMSO的问题

上面提到了DMSO是一种有毒致癌物质。那么，解冻之后，应不应该去除冻存液中的DMSO呢？答案是no。除了极少数特别注明的对DMSO敏感的细胞外，99%的细胞都不需要去除DMSO。解冻后的频繁换液会慢慢去除掉DMSO的。

7物离乡贵，人离乡贱

解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡。这和一个人突然离家千里，会水土不服是一样的道理。

细胞培养是个苦活，根本离不开人。毛博还记得当年当实验狗的时候，放个长假都要惦记着培养箱里面的细胞是不是该换液了。而掌握了有效的冻存和复苏的技术，就可以解决这个问题。春节回家前把细胞都冻上，过了年回来再开干。

（来源：解螺旋，医生科研助手  2015-09-13）