多篇顶级文章使用CUT&RUN创新技术研究DNA-蛋白互作

染色质免疫沉淀 (ChIP) 和 ChIP-seq 等能够对蛋白-DNA 相互作用进行探索的方法，使得人们越来越了解到表观遗传调节异常会引发诸多人体疾病。核酸酶靶向切割和释放（CUT&RUN)）是一种使用靶标特异性一抗和 pAG-微球菌核酸酶（pAG-MNase）分离特异性蛋白-DNA 复合体的体内方法[1，2，3]。从细胞到 DNA 只需 1 至 2 天，并且它可以自动操作，实现最大通量和可重复性[4]。

其操作流程确实简单，非常容易学习，如图 1。

图 1. CUT&RUN 操作流程图（来自 #86652 说明书）

Cell Signaling Technology® （CST）优化后的 CUT&RUN 的操作流程如下：

抗体 & pAG-MNase 结合：

1. 细胞固定结合在 Concanavalin A 包被的磁珠上，以进行后续缓冲液和试剂的交换处理。

2. 细胞膜用洋地黄皂苷 digitonin 透化处理，以便于一抗和 pAG-MNase 融合酶进入胞核。

3. 特异一抗抗体募集靶向酶 pAG-MNase 到目标染色质区域，通过一抗和融合酶的 pAG 结构域的蛋白间互作。

MNase 酶剪切：

4. 添加 Ca²⁺ 可激活 pAG-MNase 对靶向染色质片段的剪切、释放，继而从基因组染色质中扩散出来、脱离细胞，并进入上清液中。

DNA 纯化&分析: 

5. DNA 经苯酚/氯仿提取后再进行乙醇沉淀，或 DNA 离心柱对样本进行纯化。纯化、富集的 DNA 可通过 qPCR 或 NG-seq 测序进行检测和定量分析。

CST 提供的 CUT&RUN 测定法可克服其他全基因组比对技术面临的许多挑战。CST 提供的 CUT&RUN Assay Kit 的优点包括：

需要的样本少

仅需培养 100,000 个细胞即可观察蛋白-DNA 相互作用和/或得到有关低丰度细胞类型的表观遗传信息，节省了时间。

图 2. 使用更少数量的 HCT 116 细胞来进行使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 的 CUT&RUN 时，获得了相似的结果。使用 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751（左小图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499（右小图）进行检测。使用 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 和 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量（100,000 个细胞的输入百分比）相对应的信号。使用加入到每次反应中的添加 DNA 来标准化数据。

快速得到结果

节省富集靶标染色质所花费的时间。从细胞到 DNA 仅需 1 到 2 天。

节省测序成本

背景相对较低是指您可在测序深度较低的情况下，区分您的信号与基因组背景噪音。仅需 300 - 500 万次高质量读取便可获得测序数据，显著降低了您的测序成本。这种方法的低背景还可能用于分析低信号基因组特征。

靶标通用

纯化、富集的 DNA 可用于测序和/或 qPCR 实验，以研究组蛋白、组蛋白修饰、转录因子和辅因子。

在研究转录因子 DNA-蛋白相互作用时，CUT&RUN Assay Kit #86652 的工作原理与 ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 相同，但仅需 100,000 个细胞。

图 3. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652（左小图）或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005（右小图），用 HCT 116 细胞（CUT&RUN 用 1 x 100,000 个细胞，ChIP 用 4 x 1000,000 个细胞）与 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量（相当于 1）相对应的信号。

图 4. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，用 HCT 116 细胞（CUT&RUN 用 1 x 100,000 个细胞，ChIP 用 4 x 1000,000个细胞）和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备 DNA 库。小图 A 比较了 H3K4me3 在染色体 12 上的富集，而小图 B 则比较了 H3K4me3 在已知靶标 GAPDH 基因上的富集。输入通道为 CUT&RUN 中的输入样品。

在研究转录因子 DNA-蛋白相互作用时，CUT&RUN Assay Kit #86652 的工作原理与 ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 相同，但仅需 100,000 个细胞。

图 5. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652（左小图）或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005（右小图），用 HCT 116 细胞（CUT&RUN 用 1 x 100,000 个细胞，ChIP 用 4 x 1000,000 个细胞）与 CTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 和 human c-Myc promoter primers、SimpleChIP® Human H19/Igf2 ICR Primers #5172 和 SimpleChIP® Human α Satellite Repeat Primers #4486 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量（相当于 1）相对应的信号。

图 6. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，用 HCT 116 细胞（CUT&RUN 用 1 x 100,000 个细胞，ChIP 用 4 x 1000,000 个细胞）和 CTCF (D31H2) XP® Rabbit mAb #3418 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795  制备 DNA 库。小图 A 比较了 CTCF 在染色体 8 上的富集，而小图 B 则比较了 CTCF 在其已知靶标 MYC 基因上的富集。输入通道为 CUT&RUN 中的输入样品。

在研究辅因子 DNA-蛋白相互作用时，CUT&RUN Assay Kit #86652 的工作原理与 ChIP-qPCR 和 ChIP-seq 相同，但仅需 100,000 个细胞。

图 7. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652（左小图）或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005（右小图），用 HeLa 细胞（CUT&RUN 用 1 x 100,000 个细胞，ChIP 用 4 x 1000,000 个细胞）与 Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 或 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用  SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 和 SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers #7014、SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516 和  SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490  进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量（相当于 1）相对应的信号。

图 8. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 HeLa 细胞（CUT&RUN 用 1 x 100,000 个细胞，ChIP 用 4 x 1000,000 个细胞）和  Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 制备 DNA 库。小图 A 比较了 Rpb1 在染色体 12 上的富集，而小图 B 则比较了 Rbp1 在已知靶标 GAPDH 基因上的富集。输入通道为 CUT&RUN 中的输入样品。

抗体通用

pAG-MNase 结合小鼠和兔抗体，从而增加了适用于 CUT&RUN 检测的抗体的目录。

图 9. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 HeLa 细胞和 Acetyl-Histone H3 (Lys27) (D5E4) XP® Rabbit mAb #8173 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795  制备 DNA 库。小图 A 比较了 H3K27Ac 在染色体 12 上的富集，而小图 B 则比较了 H3K27Ac 在其已知靶标 GAPDH 基因上的富集。

图 10. 通过使用 CUT&RUN Assay Kit #86652，用 HeLa 细胞和 Rpb1 CTD (4H8) Mouse mAb #2629 进行 CUT&RUN 和 ChIP 实验。使用  SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795  制备 DNA 库。小图 A 比较了 Rpb1 在染色体 12 上的富集，而小图 B 则比较了 Rbp1 在已知靶标 GAPDH 基因上的富集。

可重复的结果

用添加异源 DNA 标准化您的数据，即可提升您的实验可重复性。对某个指定实验内或不同实验之间的样品进行标准化。

图 11. 使用因 qPCR 分析而加入的 DNA 对 CUT&RUN 检测信号进行标准化。使用 CUT&RUN Assay Kit #86652、数量减少的 HCT 116 细胞与 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751（上小图）或 Phospho-Rpb1 CTD (Ser2) (E1Z3G) Rabbit mAb #13499（下小图）进行 CUT&RUN 检测。使用 SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 和 SimpleChIP® Human GAPDH Exon 1 Primers #5516、SimpleChIP® Human β-Actin Promoter Primers #13653、SimpleChIP® Human β-Actin 3' UTR Primers #13669 和 SimpleChIP® Human MyoD1 Exon 1 Primers #4490 进行实时 PCR 来对富集的 DNA 进行定量。每份样品中的免疫沉淀 DNA 数量表示为与输入染色质总量（100,000 个细胞的输入百分比）相对应的信号。左小图中为非标准化的富集结果。在每次反应中，按照与起始细胞数量成比例的方式添加 Sample Normalization Spike-in DNA。根据每份样品中添加 DNA 所产生的 qPCR 信号差异，将 CUT&RUN 信号标准化为含 100,000 个细胞的样品。右小图中描绘了标准化富集。

避免出现“交联假象”

CUT&RUN 适用于天然染色质，并且无需进行可能会出现“交联假象”的交联或免疫沉淀。

重磅 1. CUT&RUN Assay Kit #86652

CUT＆RUN 检测试剂盒可以用于 24 次样本检测。试剂盒包含实验所需的 19 种试剂盒组分。试剂盒中除了提供功能强大的 Protein AG-MNase 酶，还超值提供非常重要的阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 和阴性对照 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) ，这两个对照都可以用于 qPCR 或二代测序（NG-seq）分析。PCR 引物组可与对照抗体一起用于人类（# 7014）、小鼠（＃7015）RPL30 基因座。整个试剂盒与 qPCR 和 NG-seq 兼容。

点我下载 CUT&RUN 英文操作说明书。

另有中文说明书，请拉至「阅读原文」，点击索取。

重磅 2. DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209

跟 ChIP 实验一样，CUT＆RUN 需要在 qPCR 或 NGS 之前进行 DNA 纯化，这一步骤可以使用苯酚氯仿实现，但是 CST 内部验证发现，在 ChIP 实验中使用的旋转柱也可以达到 DNA 纯化效果。如果您想使用旋转柱进行 DNA 纯化，可以选择该货号产品。点击查看详情

重磅 3. CST 近期将推出 30 个经过 CUT&RUN 验证的抗体，请及时查看 CST 官网

欢迎联系 CST 授权代理商购买；如有问题，请扫码简单填写技术咨询表。我们深谙 ChIP 和 CUT&RUN 的技术支持将会第一时间与你联系。

综上所述，如果您想检测染色质蛋白的结合位点，但是在实验中能检测的细胞数目很少，或希望在尽量短的时间内得到实验数据，CUT&RUN 是一种很好的实验方法。

点我查看 CST 最新的 CUT&RUN 产品 

【参考文献】

1. Skene PJ, et al. (2018) Nat. Protoc 13, 1006-1019.

2. Meers MP, et al. (2019) BioRxiv 1, 569129.

3. Skene PJ, and Henikoff S. (2017) Elife 6, e21865.

4. Janssens DH, et al. (2018) Epigenetics Chromatin 22(1), 74.

5. Liu N, et al. (2018) Cell. 173 (2): 430–442.e17

6. Weikun Xia, et al. (2019) Science 365(6451), 353-360, aaw5118

7. SJ Hainer, et al. (2019) Cell, 177(5), 1319-1329.ell

Cell Signaling Technology 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标。SimpleChIP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。Tapestation 是 Agilent Technologies, Inc. 的注册商标。XP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的注册商标。AMPure 是 Beckman Coulter, Inc. 的注册商标。Bioanalyzer 是 Agilent Technologies, Inc 的注册商标。Illumina 是 Illumina, Inc 的注册商标。SPRIselect 是 Beckman Coulter, Inc. 的注册商标。美国专利号 5675063。

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