微生物多样性测序需要多少重复？

之前，在我们的某一期生信培训班，对“微生物群落多样性的测序是否需要重复”的问题做过细致的讲解，显然这个过程是必不可少的，并从生物学、统计学以及实操上说明了生物学重复的重要性。

那么，微生物多样性测序需要做多少重复呢？3个、5个、7个还是以上呢？下面围绕生物学、统计学、操作便捷性及成本4个方面展开讨论。

一般的分析需要多少样本重复数才能正常开展？需要确定一下分析的可行性，那么需要依靠重复样本才能实现，无外乎为t检验、秩和检验等差异检验。

每组一个重复不能开展差异检验分析，那么每组3个重复是否就可以了？从统计学来说，3个重复确实可以。例如一般的t检验，每组至少3个重复就能算均值方差，从而进行t检验。

但t检验本身需要依赖数据符合正态分布，而在多次随机抽样中，微生物的丰度分布并不一定符合正态分布，因此，有时候需要开展无监督检验方法。Wilcoxon秩和检验就是一种常用的方法，但我们通过其检验临界表可以发现，在0.01的水平下需要 至少 5个重复才能找到数据，才能开展分析。

因此，要开展有效的差异检验分析，必须至少3个样本重复（t检验）才可以。5个样本重复（秩和检验）也可以。

考虑完分析的可行性后，接下来讨论其合理性，也就是多少重复才算比较有数据代表性。就拿微生物样本来说，其影响因素繁多，且样本物种种类复杂，因此相比于转录组等样本来说，其离散程度较大。同时，由于人为误差的必然存在（如采集到极端样本、操作失误等），就算3，5个样本重复统计出来的显著差异，实际上并没有太多生物学意义。

然 而 ，在进行容错率越低的研究的时候（例如药物研发，疾病机理等），需要更多的样本重复来消除背景误差，以精确的找到目标，。

同时，样本的复杂程度越高，理论需要的重复数也越多。因此推荐，一般的水体研究，可以开展5个左右重复，土壤10个以上，而人体肠道微生物研究，则推荐20个以上样本。

实验条件的差异，会造成测序结果的数据量差别很大。如：同一批数据，同一组中重复a、b的tag数目都是30万，重复c则是10万。对于这种数据量差异问题， 我们可以采用抽平分析策略来解决