实验时间 | 细胞冻存和复苏实验步骤

细胞冻存和复苏可以：（1）用于生物学保种；（2）用于医学上干细胞研究；（3）用于传代培养。

实验原理

细胞冻存的基本原则是慢冻快融，这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

实验步骤

1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。

3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。

4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5. 试剂：D-Hanks 液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

1. 配制含 10% DMSO 或甘油、10～20% 小牛血清的冻存培养液。

2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15 ml 离心管中。

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