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文献概述
背景：肥大细胞（MCs）是一种免疫细胞，在机体对过敏原的反应和抵御病原体方面起着至关重要的作用。激活后MC会释放多种介质，包括蛋白酶、细胞因子、组胺和脂质介质，这些介质与各种疾病的发展有关，包括过敏、哮喘、自身免疫性疾病和感染。MCs在结直肠癌（CRC）中的作用仍不清楚，尚未对CRC MCs进行全面的单细胞研究。
方法：本研究采用多组学方法，整合单细胞测序、空间转录组学和bulk组织测序数据，研究MCs在CRC中的异质性和影响。
结果及结论：与正常组织相比，CRC中的MC密度较低，但CRC中的MC表现出明显的激活特征，大多数基因包括5个MC特征基因（TPSAB1、TPSB2、CPA3、HPGDS和MS4A2），在活化的MC中以较高的水平表达，MC表型从高表达CMA1的静息状态转变为高表达TPSAB1和CPA3和KIT的活化细胞。MC特征与CRC和泛癌患者队列中较好的预后有关。肿瘤微环境成纤维细胞和内皮细胞中KITLG表达升高可能通过KITLG-KIT轴激活MC，从而抑制肿瘤进展。
文献内容
1.CRC中MC特征基因的鉴定和MC密度降低
这项研究分析了三个大型CRC单细胞数据集（GSE164522、GSE178341和5个队列），包括341个样本和总共953,493个细胞，鉴定出8875个MC。注释细胞亚群包括T细胞（CD3D、CD3E）、NK（KLRF1、GNLY）、B（CD19、MS4A1）、浆细胞（MZB1、IGHA1）、MCs（TPSAB1、TPSB2、CPA3）、髓样细胞（LYZ、CD68）、内皮细胞（PECAM1、VWF）、上皮细胞细胞（EPCAM， AGR2）和成纤维细胞（DCN， COL1A2）。建立了严格的差异基因筛选标准（log2FC>1、MC中表达细胞的比例（PCT1）>0.7、其他细胞类型中表达细胞的比例（PCT2）<0.3，P<0.01）作为MC标记的高表达基因。五个基因（TPSAB1、TPSB2、CPA3、HPGDS和MS4A2）在所有三个单细胞数据集中为共同的DEG，被定义为MC特征基因。
MC特征基因用作MC标记物，以评估肿瘤和正常组织的bulk RNA-seq样本中MCs的密度。5个MC特征基因仅在KIRP、KIRC和THCA中显著增加，其他几个癌症中显著减少，表明大多数肿瘤的MC密度降低。随后对其他CRC队列的分析证实CRC的MC密度显著降低，且wb和IF进一步证实了CRC内的MC密度显著降低。
2.CRC中MC的激活
活化的MCs是指受到外部因素刺激的MCs，它们释放生物活性物质，包括组胺、细胞因子、蛋白酶和脂质介质，如白三烯和前列腺素。
使用CIBERSORT算法比较了TCGA-CRC数据中CRC和正常组织之间的免疫细胞比率，并观察到CRC中激活的MC比例显著增加，而静息MC的比例降低。
与正常组织中富集的DEG相比，所有三个单细胞数据集（GSE164522、GSE178341和队列）MCs中富集的DEGs数量均显著更高，表明在CRC进展过程中MCs的基因表达广泛增加。TMEM176B和CD52在所有三个数据集中均位列前5位重要基因。使用在两个或多个数据集中增加的DEGs（n=268）进行GO富集分析显示与细胞活化相关的通路在CRC的MC中富集最显著。
为了更好地了解MCs在CRC进展过程中的激活特征，本研究分析了5队列数据集中与 MCs相关的受体和介质基因的表达。
MCs是表达IL-33（IL1RL1）和KIT受体的主要人群，其中MRGRPX2、CSF2RB和AHR的表达水平最高。此外MCs显示出特征蛋白酶的高表达，包括TPSAB1、TPSB2、CPA3、CMA1和CTSG。MCs还显示出参与组胺生物合成（HDC）、白三烯生物合成（LTC4S、ALOX5OP 和 ALOX5）和前列腺素生物合成（HPGDSs、PTGS1、PTGS2）的基因的高表达。MCs是唯一表达编码多种细胞因子、趋化因子和生长因子的mRNA的细胞群，包括IL4、IL5、IL9、IL13、CCL1、LIF、CSF1和AREG。
在5个队列中比较了CRC MC和正常MC中 MC受体和介质的表达和GSE178341数据集。大多数基因在CRC MCs中显著上调，表明与正常MC相比，CRC MCs具有更活跃的MC表型。
3.CRC中MC的异质性
在GSE178341队列中，对4155个MC的分析导致鉴定出对应于4个不同MC亚型。分别富含MZB1和CD3D的MC11和MC12簇分别被认为是B和T细胞双联体，而分别富含干扰素相关基因（IFIT）和线粒体基因（MT）的MC09和MC10被归类为“其他MCs”。MC08簇富含与增殖相关的基因MKI67为“增殖MCs”。根据MC受体和介质基因的总体表达水平，相对较高的MC01-04为“活化的MCs”，而MC05-07为“静息MCs”。
与静息MC相比，活化MC中MC激活基因的显著富集进一步支持了这些MC簇的命名。CRC中激活的MCs的比例显著升高，而正常组织中静息MCs的比例显著升高，表明CRC中MC的激活是由于激活的MC比例较高。
在活化MCs和静息MCs的比较中，大多数MC受体和介质相关基因，包括五个主要MC特征（TPSAB1、TPSB2、CPA3、HPGDS 和 HS4A2），在活化的MCs中富集，而 CMA1在静息MCs中富集。GSVA分析显示通过NF-κB的TNFA特征在活化的MC中富集最显著，而血管生成相关通路在静息MC中富集。
血管生成评分结果证实了与活化的MC相比，静息MC的血管生成特征更高。
此外使用Monocle2的拟时序分析从静止到激活MC的过渡，在此期间还观察到CMA1表达下降。
4.高MC特征与肿瘤的良好预后相关
基于TCGA泛癌数据的Kaplan-Meier模型发现5个MC特征基因的高表达与更好的无病生存率相关。
此外使用了基于单变量Cox回归和OS、DSS、DFI和PFI的Kaplan-Meier模型的8个预后指标来评估MC特征对不同癌症预后的影响。如果至少四个指标达到统计显著性（p<0.05），则认为结果可靠。结果显示MC特征在ACC、CESC、CHOL、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、PRAD和SARC等10种癌症类型中具有显著的保护作用，但仅与STAD的不良预后相关。
TCGA-CRC（p=0.019）和GSE39582（p=0.029）也表明，高MC特征与CRC队列中更好的总生存期相关。
此外使用CIBERSORTx深入研究MC表型对预后的影响，并观察到与正常组织相比，CRC样本中活化MC的比例更高，同时静息MC的减少。通过CIBERSORTx计算的活化和静息MC的比例与CRC预后的关系没有发现统计学上的显著差异。
5.KITLG/KIT信号转导在MC激活和CRC抑制中的作用
旨在确定CRC TME中MC激活的潜在原因。使用GSE178341数据集进行了 CellphoneDB分析，发现与静止MC相比，激活的MC与其他细胞类型的相互作用次数更多。预测结果还显示，活化的MCs与髓系、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞的相互作用受体数量最多。
既往研究表明，KITLG（SCF，干细胞因子）和IL33是分别通过与表面受体KIT和IL1RL1结合来促进MC激活的关键分子。为了研究IL33-IL1RL1和KITLG -KIT轴与MC激活之间的关系，CellphoneDB分析发现与静息MC相比，活化的MC中与上游细胞相互作用的KITLG -KIT轴的平均表达显著更高。
此外单细胞分析确定了IL1RL1几乎只在内皮细胞中表达，而KITLG主要在内皮细胞和成纤维细胞中高表达，其次是上皮细胞。
KITLG在CRC成纤维细胞和内皮细胞中的表达显著高于正常组织。内皮细胞的进一步亚组分析显示，KITLG表达在tip细胞中富集，tip细胞是以ESM1和PGF为标志的亚群，在CRC中显著升高。在TCGA-CRC和GSE39582队列中观察到KITLG和KIT表达之间存在显著的正相关。这些发现表明，KITLG在CRC中内皮细胞和成纤维细胞中表达的增加可能是MC激活的重要原因。
通过体外实验进一步探讨了MCs中KITLG/KIT通路激活对CRC细胞增殖和迁移的影响。最初，进行PCR和Wb分析以评估与KITLG共培养48小时后KIT在P815细胞系中的表达。两种检测都证实了P815细胞中KIT表达升高，验证了MC中KITLG/KIT信号通路的成功激活。
随后CCK8和Transwell检测显示，随着KITLG浓度的增加，KITLG激活的P815细胞(肥大细胞)的存在导致CRC细胞的增殖和迁移显著减少。相比之下在MC38细胞系的培养基中单独添加KITLG不会对CRC细胞行为产生任何显著变化。这些结果表明，KITLG可以通过其对MC的作用来抑制CRC细胞增殖和迁移。
综上所述研究结果表明，KITLG/KIT信号通路可能是激活MCs的关键机制，进而抑制CRC细胞的增殖和迁移。6.MC与成纤维细胞和内皮细胞的空间共定位
使用空间转录组学数据分析了MCs在CRC组织中的空间分布。根据转录组表达和HE组织信息，将3,138个点分为三个区域：正常区、基质区和肿瘤区。
基质区富含成纤维细胞（DCN、COL1A2）和内皮细胞（PECAM1），5个MC特征基因和KIT、KITLG也在基质区显著富集，表明MCs在空间上与成纤维细胞和内皮细胞共定位。
MC与基质区域内壁细胞（RGS5和ACTA2）也空间共定位。
IF证实了KIT和KITLG蛋白在CRC组织基质的共定位。
此外MC激活特征也显示基质区域的富集，表明基质环境可能是CRC中MC激活的关键生态位。
最后对配对CRC和NC样本的免疫荧光结果显示，MC均匀分布在散布在内皮腺结构之间的基质区域内。至关重要的是观察到与NC配对样本相比，CRC组织内单个MC中CMA1的表达显著降低，同时TPSAB1和KIT增加。证实了肿瘤形成过程中MCs从静止表型转变为激活表型。
