今天讲的这篇文章，挺有意思，他们通过发现Tim3的棕榈酰化，进而引申出一种可以阻碍微环境中免疫细胞抑制的药物。这篇就是山东大学齐鲁医学院博士生，发表在17.6分的Science大子刊Sci Immunol上的文章。这篇文章通过对于Tim3基因的棕榈酰化的分析，逐步推断出与其结合的棕榈酰转移酶，然后再加以应用，通过假设和假设的迭代逐步推进了整个课题的进展（假设和假设的迭代是一篇文章或者一个课题必须具备的过程，对于推动课题的进展，有着很重要的意义，不清楚的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。我们就一起来看看这篇文章讲了点啥吧：
首先他们研究的这个Tim3（简称T蛋白），是与CD8+ T细胞耗竭以及NK细胞功能失调密切相关的，T蛋白主要是在内质网上合成并进入细胞膜。抑制T蛋白表达，可以回复CD8+ T细胞和NK细胞功能。他们发现，小鼠的T蛋白和灵长类的T蛋白之间，是有一定的差异的，小鼠的T蛋白在激活后缓慢表达，而灵长类包括人类的T蛋白在CD8+ T细胞中被激活后是迅速升高表达的。通过序列分析，他们发现小鼠的T蛋白尾部比灵长类的T蛋白少了11个氨基酸残基（这其实就是通过米勒五法的求异法，来进行分析，在两种T蛋白表现出表达差异的情况下，而他们之间又存在序列差异，那么是否是由于序列差异导致的表达差异呢？不清楚米勒五法的话，可以去看看《列文虎克读文献》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。那么要如何验证呢？就是对人类的T蛋白尾部的氨基酸进行敲除，当缺失了T蛋白尾部的11个氨基酸残基后，人类T蛋白的稳定性明显下降了，这也就说明了这11个氨基酸残基对于T蛋白稳定性的重要意义：
那么这11个氨基酸残基，是如何维持T蛋白稳定性的呢？他们想到了棕榈酰化，对于蛋白稳定性有着一定的意义。而通过预测，他们发现T蛋白的这11个残基中，的确有一个氨基酸残基是可以被棕榈酰化的，经过验证，这个氨基酸残基的确产生了棕榈酰化。那么这个棕榈酰化的氨基酸残基，是否对于T蛋白稳定性至关重要呢？他们就对该氨基酸残基，进行了突变验证，将半胱氨酸残基突变成了无法修饰的丙氨酸（这里其实就是柯霍氏法则的验证，但他们将命题的外延缩小到了棕榈酰化的氨基酸残基，而不是通过整体的棕榈酰转移酶的抑制，这样可以避免肯定后件的逻辑谬误，可以说这里的验证是十分恰当的。不清楚柯霍氏法则的验证，或者肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《轻松的文献导读》、《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。结果也显示了T蛋白尾部11个氨基酸残基中的这个半胱氨酸残基的棕榈酰化，对于T蛋白的表达以及稳定性，都有着比较关键的作用：
那么T蛋白的棕榈酰化，是如何影响蛋白稳定性的呢？于是他们就对T蛋白的降解进行了进一步的分析，结果发现，T蛋白的降解主要是通过泛素化后的蛋白酶体水解途径降解的，而T蛋白在半胱氨酸残基突变后（无法棕榈酰化），其泛素化水平也明显得到了提高。T蛋白在内质网中错误折叠会导致降解，而这个过程中T蛋白会与E3连接酶结合（泛素化过程中，需要通过E2连接酶和E3连接酶对于底物蛋白进行泛素化修饰，而E3连接酶又是泛素化过程中的关键因素，不清楚泛素化通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的泛素化途径），而他们发现ER降解途径中的E3连接酶可以结合T蛋白。当T蛋白棕榈酰化的半胱氨酸残基被突变后，其与E3连接酶的结合也被抑制，同时T蛋白的泛素化相关的赖氨酸残基的泛素化也被抑制了，这可能就是T蛋白的棕榈酰化维持其稳定性的关键：
那么T蛋白的棕榈酰化，是通过哪个棕榈酰转移酶引起的呢？他们是通过几个关键的棕榈酰转移酶的敲减，来进行筛选的。通过筛选他们找到了关键的棕榈酰化转移酶，并验证发现该棕榈酰化转移酶可以对T蛋白棕榈酰化，并阻遏T蛋白被E3连接酶泛素化修饰：
而这个棕榈酰转移酶在肝细胞癌中的肿瘤浸润CD8+ T细胞和NK细胞中高表达，敲减了该棕榈酰转移酶，可以有效缓解CD8+ T细胞的耗竭：
那么有没有什么方法可以靶向性地抑制棕榈酰转移酶与T蛋白之间的结合呢？这样其实就可以避免整体的棕榈酰转移酶抑制导致的不可预知的后果（这里其实就是假设迭代的过程，通过假设迭代，推进了整个课题的进展，而试图找出靶向性针对棕榈酰转移酶与T蛋白之间的阻遏物，可以缩小验证命题的外延，避免逻辑谬误，不清楚假设迭代、命题外延以及逻辑谬误的话，可以去看看《列文虎克读文献》、《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）。于是他们分析了棕榈酰转移酶与T蛋白的结合，有意思的是T蛋白尾部的11个氨基酸刚好能结合棕榈酰转移酶。也就是说单独的这11个氨基酸的多肽，是可以作为竞争性抑制剂，靶向抑制棕榈酰转移酶与T蛋白结合的。而实验验证结果，也正是如此：
而使用了这种靶向T蛋自棕榈酰化的多肽抑制剂，可以增强NK细胞和基于CAR-T细胞的肿瘤免疫疗法：
看完这篇文章，其实总体的思路非常顺畅，通过人类T蛋白和小鼠T蛋白的不同表现，分析出二者之间的差异，并引入棕榈酰化分析。在棕榈酰化后，又确定了棕榈酰化与T蛋白泛素化降解的联系。最后通过靶向T蛋自棕榈酰化的多肽进行竞争性抑制，来达到施用与临床的目的：
总的来说这篇文章是非常不错的，可以值得大家好好学习一下。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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