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四川大学王娜老师课题组ACS Catal.：通过蛋白质工程改造羰基还原酶ChKRED20并将其应用在不对称合成手性稠环内酯

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2024-12-30 16:38

正文

▲第一作者：施明亮

通讯作者：王娜

通讯单位：四川大学化学学院

论文DOI：10.1021/acscatal.4c05196（点击文末「阅读原文」，直达链接）

全文速览

本研究通过蛋白质工程对羰基还原酶ChKRED20进行了（半）理性设计，获得了几种优异的立体互补突变株并应用于手性稠环内酯的不对称合成。

背景介绍

稠环内酯是许多天然产物、药物和合成分子中的重要合成砌块，特殊的多杂环结构使其具有多种多样的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗炎症等。γ-内酯是许多构成昆虫和植物中重要信号化学物质的基础结构。同时，γ-内酯类化合物天然存在于乳制品、水果和坚果等产品中，不同的内酯结构使得这些天然产品具有特有的香味。对于具有多个立体手性中心的稠环内酯类化合物，不同的立体构型会赋予这些化合物不同甚至相反的生物活性。因此，如何不对称合成这类具有高对映和非对映选择性的化合物是一个巨大的挑战。

本文亮点

本课题工作通过蛋白质工程对羰基还原酶ChKRED20进行了（半）理性设计，在活性空腔附近定位了两个重要氨基酸Y188和H145，仅通过对这两个氨基酸的组合突变，获得的具有优良催化性能的ChKRED20立体互补突变株能够还原多种γ-酮酸酯化合物，实现了20种芳基三稠环内酯的立体发散性生物合成。

图文解析

我们首先选择消旋体2a作为模板底物，考察了不同突变体对消旋体rac-2a的还原内酯化反应。第188位氨基酸的改变对该还原反应具有重要影响，随后使用定点饱和突变技术（site-saturation mutagenesis, SSM）对188位酪氨酸进行了改造并对其进行了实验考察，得到的具有优良催化性能的4种突变株M3C2（M2+Y188C）,M3C3（M2+Y188G）,M3C4（M2+Y188N）和M3C5（M2+Y188A）均能以超过40%的产率得到(3aR,9bS)构型的稠环内酯2e（图1c）。此外发现突变株M4A1（M2+Y188S+H145A）能够获得具有翻转构型的稠环内酯（3aS,9bR-2e, 48% e.r.）。突变后的第145位丙氨酸可能与底物的末端酯基具有疏水相互作用，导致底物在活性空腔中的结合构象发生了翻转。

图1.ChKRED20不同突变株对还原反应的影响

随后我们考察了该反应体系的底物范围，使用了五种优良突变株M3C2，M3C3，M3C4，M3C5，M4A1和M4B1并研究其对20种芳基γ-酮酸酯的还原（图2）。M4B1主要生成顺式的消旋体稠环内酯e，M3C2，M3C3，M3C4和M3C5生成以(3aR,9bS)为构型的稠环内酯，而M4A1则能生成以(3aS,9bR)为主要构型的稠环内酯。其中16e在M3C3和M4A1中实现了完全的手性翻转（从>99:1 e.r.到<1:99 e.r.）。芳环或脂肪环中具有杂原子的底物也能够在这5种突变株中被还原并生成相应的具有高对映和非对映选择性的稠环内酯（17e-21e）。同时对16e，17e，19e，20e和21e进行了放大反应实验，以百毫克级实现了(3aR,9bS)-17e的合成，证明了该生物催化平台在替代传统手性金属催化法以实现稠环内酯立体发散性合成的应用潜力。

图2.底物谱

模板底物2a在具有高对映选择性的ChKRED20突变株中以及优化反应条件下均遵循动力学拆分反应过程（如在突变株M3C3中，R构型2a全部被还原，而剩余的S构型2a则难以被还原，内酯理论产率<50%）,得到的产物均为顺势构型（cis），而反式构型（trans）产物无法检测到。在图3a-3和图3a-4展示了若要得到反式构型产物时底物在活性位点中最合理的结合模式，推测在这两种结合模式中底物羰基α位的侧链基团具有位阻效应，因此亲核进攻距离（NADH上氢原子到底物羰基碳的距离）要比图3a-1和图3a-2中的亲核进攻距离更远（图3b-1中的4.0 Å，图3b-2中的6.2 Å），导致反式构型的产物无法在ChKRED20的活性空腔中得到。

图3. (a)底物、质子供体Y156和氢负离子供体NADH在ChKRED20中发生亲核进攻时的能量有利(1,2)和能量不利(3,4)的结合模式；(b)R构型和S构型的2a在M3C3和M4A1中的动力学模拟。

在底物普适性研究的过程中，有几种稠环内酯能够以超过50%的产率获得且具有高对映选择性和非对映选择性（>99% e.e., >99% d.e., 3e，15e，16e，17e，18e，19e）。如图4右所示，与模板底物2a不同，消旋体18a在48小时内全部消耗完并生成单一构型的(3aS,9bS)-18e，因此我们猜测R构型的底物18a在还原反应过程中发生了消旋化。β-酮酸酯发生烯醇互变异构化所需能量较低，而γ-酮酸酯的烯醇形式通常具有不稳定的共轭结构，导致γ-酮酸酯发生烯醇互变异构化所需能量要更高，因此在酮的α位具有手性碳原子中心的γ-酮酸酯难以通过烯醇互变来进行消旋化。我们认为由于底物结构不同，酶能够在催化还原过程中通过质子化-去质子化的过程介导部分底物（如3e，15e，16e，17e，18e，19e）的烯醇互变异构化（图5a）。因此该反应体系中存在动力学拆分-不对称还原（KR-AR）和动态动力学不对称转化（DyKAT）两种反应历程，二者的差异取决于非优势反应构型的底物在酶中发生烯醇互变的能垒高低。