免疫细胞体内追踪

闲谈Immunology · 公众号 · · 2024-08-31 09:48

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肿瘤进化过程中，癌细胞获得增殖、侵入邻近组织、逃避免疫系统和全身扩散的能力。跟踪这一过程，对于人类战胜肿瘤至关重要，但是极具挑战性，因为许多关键事件是随机和长时间发生的。体内谱系追踪技术，有助于我们更清晰了解这些关键时间。同样的技术也有助于过激免疫细胞治疗，可以了解免疫细胞进入人体后的增殖、分化等。

基于重组酶的谱系追踪方法

依靠重组酶诱导 DNA 靶位点之间的重组，将静态谱系报告基因引入细胞，以可预测的方式产生倒位或缺失。

通常，重组酶用作诱导可遗传报告基因（例如荧光蛋白）表达的开关。

通过使用多种重组酶或通过设计分裂重组酶系统，每个片段由不同的启动子驱动，只有表达两种启动子的细胞才能成功实现重组，标记特定细胞类型的能力得到了提高。

稀有细胞的稀疏标记，例如使用Cre-ER（雌激素受体）和低剂量他莫昔芬，是提高标记分辨率的一种解决方案，但需要注意的是，标记的细胞不代表总体群体。为了克服这个问题并对单个克隆进行更全面的分析，研究人员使用多色报告基因。

基于合成条形码的沿袭追踪方法

下一代测序技术和高多样性DNA条形码技术的快速发展已经解决了荧光报告基因有限多样性的挑战。

该技术的早期版本利用携带明确DNA序列的载体，这些序列可以稳定地引入细胞中以区分克隆；进一步的改进用高多样性随机条形码序列替换了预定义的序列。条形码是可遗传的，来自每个标记细胞克隆的所有后代都将继承相同的条形码。该技术有助于在广泛的癌症相关研究中实现高分辨率和定量分析，包括分析肿瘤进展和克隆动力学、绘制原发性肿瘤-转移关系图，以及确定耐药性的起源。

最近出现的单细胞技术催生了基于DNA条形码的谱系追踪技术的新浪潮。一个根本的进步是将DNA条形码与RNA报告基因配对（例如，通过在转基因的3' UTR中插入随机条形码）。这导致细胞包含多个 DNA 条形码的 mRNA 拷贝，从而能够使用单细胞 RNA-seq （scRNA-seq）技术进行观察。

scRNA-seq 和 DNA 条形码的配对对克隆特异性分化层次结构、动力学和偏差产生了丰富的见解。

为了扩大与不同数据模式的兼容性，研究人员开发了各种条形码来实现表观基因组学或蛋白质组学分析。将谱系追踪与其他基因组技术相结合可能很强大。比如将单细胞条形码技术与 RNA FISH（荧光原位杂交）、CRISPR/Cas9诱导的移码突变或 CRISPR 激活（CRISPRa）结合。

CRISPR/Cas9条形码技术

不断发展的条形码工具的核心是：在实验过程中，随机性需要以一种在整个细胞分裂中遗传的方式不断引入预定义的遗传位点。此类方法的最常见版本利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在特定合成 DNA 便签存储器或靶位点引入随机突变。

每种策略都依赖于三个基本成分：Cas9核酸酶，整合到基因组中的DNA靶位点，以及将Cas9特异性靶向靶位点的单向导RNA（sgRNA）。

这三个组分共同使Cas9能够在DNA靶位点位点引入靶向双链断裂，随后以容易出错的方式进行修复，以产生可遗传的插入或缺失（插入）。

重要的是，这些DNA靶位点可以被转录成多腺苷酸化的mRNA，允许它们与所有其他细胞mRNA一起被捕获和分析，使用大规模平行的scRNA-seq技术。通过这样做，这种方法可以直接将当前细胞状态（通过scRNA-seq测量）与其过去的历史（由谱系记录器捕获）联系起来，并大规模地这样做。

其他不断发展的追踪工具

虽然Cas9是一种高效、灵活且常用的谱系追踪工具，但存在三个限制。首先，Cas9编辑产生的DNA双链断裂会导致细胞应激和潜在的细胞毒性。其次，对插入缺失的类型和大小几乎没有控制，并且很难测量大量编辑。第三，使用Cas9编辑相邻DNA靶位点的阵列存在将多个位点折叠在一起的风险，从而丢失中间信息。

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