文章摘要
颗粒污泥上浮是高负荷厌氧氨氧化反应器稳定运行的重大瓶颈，但污泥上浮原因仍不明晰，因而缺乏有效控制手段。本研究提出了一种基于外源叶酸投加的新型控制策略，试验结果表明，氮负荷为12.3 kg-N/(m
3
·d)时，外源连续投加8 mg/L叶酸可有效缓解厌氧氨氧化颗粒污泥（AnGS）上浮（上浮潜力下降67.1%）。考察叶酸投加前后颗粒污泥的理化特性发现，胞外聚合物（EPS）含量（主要是蛋白质）的下降、颗粒表面孔隙堵塞的缓解以及产生氮气的顺利释放是污泥上浮缓解的主要原因。此外，宏基因组分析表明，在外源投加叶酸后，厌氧氨氧化菌与其伴生菌（叶酸合成菌）间的协作减弱。厌氧氨氧化菌降低了对伴生菌的依赖，并减少了对伴生菌的代谢物（例如EPS中的氨基酸和碳水化合物）供应，导致了EPS产量降低，疏通了颗粒污泥堵塞的孔隙，进而缓解了污泥上浮并实现了反应器高效稳定运行。本研究不仅为微生物互作在颗粒污泥上浮中的作用提供了新见解，还为厌氧氨氧化颗粒污泥上浮控制提供了一种可行的方法。
主要内容
1.
反应器运行性能
反应器运行198天，共包括四个阶段。阶段I（第1-71天），进水TN浓度由312.7 mg-N/L逐步提升至793.5 mg-N/L，NLR由4.9 kg-N/(m
3
·d)上升至12.3 kg-N/(m
3
·d)。同时，总氮去除负荷（NRR）由4.3 kg-N/(m
3
·d)上升到10.9 kg-N/(m
3
·d)。随后NLR保持稳定。阶段II（第72-91天），初期，反应器运行性能相对稳定。而第82天，大量AnGS上浮，反应器污泥浓度由第82天的18.2 g-VSS/L迅速降低至第90天的11.8 g-VSS/L（下降35.2%），导致出水TN急剧增加至285.5mg-N/L。相应地，TN去除效率（NRE）和NRR分别降低至63.6%和7.9 kg-N/(m
3
·d)。为恢复反应器运行性能，物理破碎上浮AnGS，并在第92天投回反应器。随后，反应器运行性能逐渐恢复。然而，仅维持稳定运行两周后，AnGS在阶段III（第115天）末期再次严重上浮，运行性能再次恶化。阶段IV（第124-198天），第124天在进水中投加叶酸（浓度为8 mg/L）。随后，反应器运行性能逐步恢复，并实现高效运行，NRE和NRR分别稳定在88.9%和11.2 kg-N/(m
3
·d)。
图1 厌氧氨氧化反应器运行性能。
（A：进出水氨氮、亚硝氮和硝氮浓度；B：氮负荷率（NLR）、氮去除负荷（NRR）和脱氮去除效率）。
2.
AnGS的沉降性能和污泥上浮潜力
颗粒污泥平均沉降速度由阶段I的1.92±0.41 cm/s下降至阶段II的1.47±0.97 cm/s。颗粒污泥的沉降速度在阶段II和阶段III无显著差异（
p
>0.05），而在阶段IV显著上升至2.32±0.47 cm/s（
p
<0.05）。AnGS的上浮潜力则由阶段I的15.8±3.1%显著上升至阶段II的71.4±8.6%（
p
<0.05）。污泥上浮潜力在阶段II和阶段III无显著差异（
p
>0.05），而在阶段IV迅速下降至22.4±3.0%（
p
<0.05）。
图2 AnGS在整个运行过程中的沉降速度（A）和污泥上浮潜力（B）。
（阶段I-IV分别指第1、86、119和188天，两组之间的不同字母表示具有显著差异，
p
<0.05，下同）。
①颗粒粒径和密度
与阶段I相比，阶段II和阶段III的颗粒污泥粒径更大。而阶段IV的AnGS的粒径略有下降（
p
>0.05）。而阶段II和阶段III的颗粒污泥密度显著低于阶段I（
p
<0.05），表明颗粒密度与污泥沉降性呈正相关。由于AnGS的异质性，部分AnGS在阶段II和阶段III仍具有较大密度，导致这些阶段颗粒污泥密度波动较大。
图3 反应器长期运行期间AnGS的体积平均粒径（A）、密度（B）和气含量（C）。
②气体含量
阶段II和阶段III的AnGS气含量明显高于阶段I（
p
<0.05），这导致了污泥易于上浮。投加叶酸后，污泥气含量从阶段III的3.9±0.6%大幅下降至阶段IV的1.6±0.1%（
p
<0.05）。这些结果表明，AnGS中的气体累积是阶段II和阶段III颗粒污泥密度下降的主因。而阶段IV添加叶酸后可降低污泥气含量，从而缓解了污泥上浮。
③三维孔隙结构
阶段I的AnGS的孔隙分布均匀，孔道自表面至内部呈放射状连接。而阶段II和阶段III的AnGS孔隙连通性下降，AnGS表层存在许多堵塞空腔，因此，随着产生的氮气量的不断积累，AnGS密度下降，导致上浮。阶段IV的AnGS表层孔隙堵塞缓解，蓄气量降低。
图4 反应器长期运行期间AnGS的三维重建图像。
（A和a、B和b、C和c、D和d 分别是指阶段I、阶段II、阶段III、阶段IV收集的AnGS；E和e指阶段IV的上浮AnGS;红色部分指功能菌和EPS，而蓝色部分指AnGS中的孔隙。白色箭头表示AnGS表层中堵塞的空腔)。
④EPS含量
与阶段I相比，阶段II和阶段III的AnGS胞外蛋白（PN）含量显著上升（
p
<0.05）。值得注意的是，PN由阶段III的220.7±11.3 mg/g-VSS下降至阶段IV的177.3±11.2 mg/g-VSS（-19.7%）。细胞外多糖（PS)含量的变化趋势与PN相似，但变化幅度较小。显微结构观察表明，与阶段IV相比，阶段III的AnGS中菌体周围含有更多的EPS，且在EPS附近发现了较多伴生细菌。表明在高NLR下AnGS中EPS含量的增加可能导致了颗粒孔隙堵塞和气体积累。而外源投加叶酸可显著降低EPS含量，从而缓解颗粒污泥孔隙堵塞并降低气含量，从而避免AnGS上浮。
图5 反应器
长期运行期间AnGS的EPS含量（A）；阶段III（B）和阶段IV（C）中AnGS的表面显微结构。
（1、2分别表示反应器AnGS和上浮AnGS；红色、黄色和白色箭头分别表示厌氧氨氧化细菌、伴生菌和EPS）。
颗粒污泥中的微生物隶属于
Planctomycetotes
，
Proteobacteria
，
Chloroflexi
，
Bacteroidetes
，
Myxococcota
，
Acidobacteriota
，
Actinobacteria
和
Armatimonadetes
。
本研究仅获得一个厌氧氨氧化菌属的基因组（AMX1），属于
Candidatus
Kuenenia。AMX1编码了大多数氨基酸和碳水化合物合成途径，而PRO3（
Rubrivivax
）编码了叶酸合成完整代谢途径。AMX1的丰度从阶段I的30.6%增加到阶段III的49.3%。而在阶段IV仍显著上升。不同阶段的厌氨氧化菌
hzs
A基因和16S rRNA基因拷贝数检测结果也与宏基因组结果一致，表明AnGS中厌氧氨氧化菌的丰度随着NLR的升高而增加。此外，投加叶酸可促进厌氧氨氧化菌的增殖。值得注意的是，尽管PRO3丰度从阶段I的1.1%增加至阶段III的1.3%，但其在阶段IV投加叶酸后下降至0.8%。这说明外源投加叶酸后，厌氧氨氧化菌与其伴生菌间的协作减弱。厌氧氨氧化菌降低了对伴生菌的依赖并减少了EPS的分泌，导致伴生菌因底物减少而丰度下降。
图6 AnGS中基于基因组的微生物相互作用（A）；AMX1（
Candidatus
Kuenenia）和PRO3（
Rubrivivax
）（B）的相对丰度，
hzs
A基因（C）和厌氧氨氧化菌16S rRNA基因（D）在不同阶段的拷贝数。（AMX1编码大多数氨基酸和碳水化合物合成途径，而PRO3编码叶酸合成完整代谢途径；图6B的数据根据阶段I获得的数据进行了归一化）。
总结
本研究考察了外源投加叶酸缓解高负荷厌氧氨氧化反应器中污泥上浮的可行性，并揭示了其潜在机制。主要结论包括：
1）外源投加叶酸（8 mg/L）可显著提升AnGS的颗粒沉降性并控制AnGS上浮，在12.3 kg-N/(m
3
·d)的高NLR下，污泥上浮潜力下降了67.1%。
2）EPS含量的降低、颗粒污泥表层孔隙堵塞的缓解以及产生的氮气的顺利释放是颗粒污泥密度增加和污泥上浮控制的主要原因。
3）外源投加叶酸后，厌氧氨氧化菌与其伴生菌间的协作减弱。厌氧氨氧化菌降低了对伴生菌的依赖并减少了EPS的分泌。
第一作者：
许冬冬
，浙江大学2023届博士毕业生，现为昆士兰大学水中心博士后。主要研究方向为废水生物脱氮与资源化，近年来发表科研论文40多篇，第一作者在Water Research、Environmental Science & Technology等期刊发表论文12篇；曾获高廷耀环保青年博士奖学金和奥加诺水质环境奖学金等。
