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液相方法开发指南-反相色谱

药事纵横 · 公众号 · 药品 · 2021-03-04 09:34

正文

前言

最近数年国内药物研发风生水起，十分火爆，而药物研发的分析领域必然经常需要开发HPLC检测方法， HPLC最常用的是反相色谱。我在这篇文章中将结合现有的成文理论与本人的心得体会，阐述我对反相色谱方法开发的理解，希望对新入行的亲们有所帮助。本文力求从实战中阐述理论，在实战中总结经验，使得看完本文的读者就能对自己实际工作中的方法开发有一个初步的构想。R-HPLC方法开发一般包含四大块的内容：检测波长、色谱柱、样品处理、流动相。下文将主要从这四个方面阐述在方法开发中如何选择上述参数。

检测波长

1.1 闲述

紫外检测器是液相中最常用的检测器，绝大部分药物在该检测器中有响应，所以本文仅阐述使用紫外检测器如何确定检测波长，其他检测器的使用将另行说明（随手挖个坑）。

1.2常见做法

目前常见的做法是用选定的稀释剂或者某个溶剂将样品溶解，然后在紫外光谱仪中进行全波长扫描，得到各组分的光谱，并确定方法的检测波长。

很遗憾的说，上面的做法不正确。我们可以想象，当组分进入检测器时，它是处在流动相中的，也就是说各组分在HPLC中的光谱表现是在流动相中的光谱表现。紫外吸收光谱有一个术语叫“溶剂效应”，是指受溶剂的极性或酸碱性的影响，使溶质吸收峰的波长、强度和形状发生不同程度的变化。这就意味着如果溶剂与流动相不一样，则上述的光谱和各组分实际在HPLC中的光谱很可能是不一致的。比如某些易解离化合物在不同pH值的溶剂中，最大吸收波长不一样。

1.3 如何确定检测波长

使用二极管阵列检测器（开发方法的时候首选该检测器）按照确定的方法进样分析，获得各组分的光谱图，检测波长一般选择主成份的波峰或者波谷处。因为在波峰或者波谷处较为平坦，波长的少许偏差响应相差不大，方法在波长这一块的耐用性较好，而在坡上则正好相反。如果是多组分含量测定，比如复方制剂的含量测定，可以使用二极管阵列检测器，分别调取不同组分的最大吸收波长响应数据。

在有关物质的检测波长选择中，有一种常见做法是将各个组分的光谱图叠在一起，选择交叉处，因为该处的各组分响应接近，即校正因子将都接近1。这种做法本人并不赞同，因为交叉处大多出于坡上，检测波长的变动将带来响应值的巨大变化，方法的耐用性非常差，甚至可能导致各组分的响应非常不稳定。本人建议波长选择主峰的波峰或者波谷，因为有关物质大部分结构与主成份类似，光谱行为接近，如有结构与主成份相差较大，响应也相差很大，可以单独制定控制方法（如外标法）。

色谱柱

应根据进样量、样品性质、仪器状态、其他组分和流动相等情况选择相应的色谱柱。

2.1进样量

如有关物质方法，各组分响应较弱，为满足灵敏度的要求，进样量较大，则需考虑色谱柱应满足荷载的要求，避免进样量大导致的柱过载使主峰展宽变形。一般这种情况大多选用大载碳量的25×0.46cm或更大规格柱，尽可能提高柱荷载。与此相对，含量测定方法一般进样量较小，为减少分析时间可以选择较短的色谱柱。

2.2样品性质

反相色谱使用的色谱柱大多是烷基键合硅胶，如C18、C8、苯基柱等。硅胶上有硅羟基，硅羟基会电离成硅氧负离子。如果供试品为碱性化合物，如盐酸厄洛替尼，弱碱强酸盐，则厄洛替尼除了会与键合相产生“相似相容”的反相色谱保留作用外，还会与硅氧负离子产生离子色谱的保留作用，即“二次保留”，导致厄洛替尼峰拖尾。

解决碱性化合物拖尾有两个办法，一个是在流动相中加入扫尾剂，相应内容见“流动相”。另一种方法是选择“封尾（也称封端）”处理的色谱柱。所谓封尾，是因为键合相一般体积较大，C18、C8、苯基等，因空间位阻使得硅胶上硅氧负离子不能完全被键合，所以用小分子烷烃与硅胶上残余的硅羟基键合，减少硅氧负离子的数量。本人一般在开发碱性化合物液相方法时选择封尾处理的色谱柱，具体封尾柱的型号见供应商说明书，文中就不一一列举，毕竟他们也没给我广告费。

酸性和中性化合物选择色谱柱不用考虑硅氧负离子的影响。

2.3仪器状态

选择色谱柱时，还需考虑仪器是否匹配，选择小粒径或小口径色谱柱，应评估仪器的最大耐受压力是否符合要求。如选择快速分析柱（短、小粒径、小口径），应考虑柱外死体积引入的峰展宽，这种情况下最好选择同一厂家的仪器与色谱柱，避免接头不匹配增加死体积。

2.4其他组分

如胶囊的溶出检测中，使用C18柱如果发现多次检测后主成分峰变形，一般是因为胶囊壳中存在强保留组分，可以选择另一种保留机制的色谱柱如氰基柱或氨基柱等。不同类型键合相保留机制各有不同，篇幅有限，另行说明吧（又挖个坑）。比如苯环上的细微差别，如多了个卤素，C18柱分不开，可以选择苯基柱，苯基柱对于苯环上细微差别有良好的分离效果。某些组分分离效果非常差，可以考虑换一个型号的色谱柱，比如从岛津的ODS-2换成安捷伦的XDB-C18，不同型号的色谱柱因为工艺的差别选择性也是有差别的，这没有规律，只能是通过实验来确认适用的色谱柱。

2.5流动相

应选择与拟定流动相匹配的色谱柱，增加色谱柱使用寿命。如流动相含0.1%磷酸，就应选择耐酸柱；反之如流动相pH较高（＞7），应选择耐碱柱。具体哪些型号色谱柱耐酸或耐碱，见供应商说明书。

样品处理

3.1稀释剂选择

稀释剂不是只把样品溶解就可以了，需要考虑“溶剂效应”，此溶剂效应与上文紫外光谱的溶剂效应不是同一个含义（题外话GC也有溶剂效应的概念，有兴趣的亲可以了解一下）。溶剂效应的具体概念及详细分析请见拙著《论液相色谱的溶剂效应》，不再赘述。选择稀释剂时，稀释剂在满足溶解供试品的前提下，应尽可能与流动相性质接近，在有机相比例、pH值等方面，但是一般很少选择流动相作为稀释剂，因为流动相配制较为麻烦，选择流动相作为稀释剂增加了工作量；还有就是很多流动相中含有缓冲盐，如果选为稀释剂，供试品溶液在进样器中产生高压盐析现象，固体盐颗粒会损坏进样器。稀释剂一般选择同初始比例的有机相-水系统。如果不溶解，需要用其他溶剂溶解的话，最好使用前述的有机相水系统稀释10倍以上。绝不能直接用其他溶剂溶解，然后进样分析，因为很可能产生溶剂效应和样品析出堵塞仪器。易解离化合物可以在稀释剂中加入盐酸或者氢氧化钠助溶。

补充说明，一般保留时间短的组分容易出现溶剂效应，减少溶剂效应可以采取的措施有减少进样量、增强保留、改变稀释剂、优化流动相。优化流动相是因为溶剂效应是稀释剂和流动相相差性质较大导致的结果，也就是二者的相互作用导致的，所以可以通过优化流动相来消除溶剂效应。

3.2供试品浓度

有关物质方法应考虑方法的灵敏度，一般主成份峰的响应值应不低于1000，并将供试品溶液稀释一万倍后信噪比应不低于10。含量测定方法应考虑主成分峰在线性范围内，不能分离的杂质峰在规定浓度下应可以忽略不计。

3.3供试品处理方法

如果供试品的处理方法毕竟特殊，还需要在质量标准中规定特殊的处理方法，则需要对供试品的处理进行相应的研究。比如片剂的含量测定，直接投片、研成细粉、除去包衣再研成细粉、超声及时间、震摇及时间、滤膜吸附、离心等等。这些处理方法都需要进行相应的研究，以保证样品的处理符合检测的需要。比如说片剂含量实际是100%，而检测结果却是90%，色谱条件没有问题，问题出在供试品处理时提取不完全。

3.4 衍生化

某些情况下样品需要衍生化才能满足质量控制的要求，如保留太弱、没有响应、异构体无法分离等。内容太多，篇幅有限，就不在本文中说明了（再挖个坑）

流动相

4.1流动相的种类

反相色谱的流动相主要是两大类：水相和有机相。水相主要分为两种：纯水和缓冲盐；有机相最常用的是乙腈和甲醇，其他还有乙醇、四氢呋喃、异丙醇等。

4.1.1 什么情况下用纯净水

供试品和主要杂质都是中性化合物（即不会电离或者不易电离）的情况下，流动相可以用纯水-有机相系统，这种情况不多，所以大多数都用了缓冲盐。

4.1.2 什么情况下用缓冲盐

供试品或主要杂质为易解离化合物，如盐酸厄洛替尼、帕瑞昔布钠等一看就是能电离的，根本不用考虑纯水，流动相需要使用缓冲盐。易解离化合物的相关内容见《易解离化合物的pKa、离子型、分子型及其HPLC保留特征》，缓冲盐使用的详细内容见拙著《方法开发缓冲盐选择指导原则》，本文不再赘述。

4.1.3 如何选择有机相

一般是根据组分的分离情况、截止波长、压力等因素选择有机相。比如甲醇和乙腈，二者的性质不一样，甲醇有氢键，乙腈是偶极矩，在组分间的选择性不一样，甲醇分不开的组分可能乙腈能分开，乙腈分不开的组分可能甲醇能分开。低波长下如205nm一般应选择乙腈，乙腈的截止波长较低，在低波长下基线较平坦，此时不应选择乙醇、四氢呋喃等溶剂。乙腈作为流动相产生的压力一般也小于甲醇、乙醇等溶剂，如果超过系统允许最大压力的风险较高，应选择乙腈作为流动相。流动相常用有机溶剂截止波长亲们需要去了解，方法选定的波长应远大于流动相的截止波长。截止波长这个概念都可以写一篇文章了（又见坑）。

4.2 如何确定流动相比例和梯度

有两种做法，一种是设置一个60分钟有机相比例从5%到100%的梯度，并根据此梯度下各组分的保留的情况决定下一步的优化策略。本人一般不这么做，我在实际工作发现这么做耗时太久，我的做法是等度逐渐降低有机相比例确定各组分的保留情况，并根据等度研究的结果确定是否采用梯度及梯度情况。

举例如下：需要建立一个有关物质检测方法，有A、B、C、D、E5个组分，极性依次增大（分析人员应能做到看化合物结构式就能判断其极性的相对大小，这对有机化学的功底有一定的要求），即在反相色谱中保留依次减小。我首先用80%有机相分析A， k值为1；分析B，无保留。则CDE三个保留更弱的组分在该条件下没有必要进样。

因为B无保留，所以有机相应直接减少20%，改变条件为60%有机相，分析B，k值为0.5；此时需要注意一个反相色谱的一个规则“三倍规则”，即有机相比例减少10%，保留值增加2-3倍。该规则可以准确预测中性化合物随有机相比例变化的保留情况，易解离化合物因为保留较为复杂，可能会有偏差。改变条件为50%有机相，分析C……分析E的时候有机相比例30%，k值为1。

液相方法开发指南-反相色谱

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