日前，来自康奈尔大学分子生物学和遗传学系的 Ailong Ke 教授研究组与哈佛医学院 Maofu Liao 研究组合作，公布了嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的 I 型 CRISPR 复合体的近原子分辨率结构，并从中揭示了 CRISPR-Cas3 这一系统的作用机制。这一研究成果公布在 6 月 29 日的 Cell 杂志上。
Ailong Ke 教授研究组主要从事 CRISPR、RNA 生物学、RNA 分子结构和功能、结构生物学等方面的研究，在核酸开关领域研究成果处于世界顶尖水平。
这项研究成果的突破所在：新研究获得了近原子分辨率的结构图像，解析了 CRISPR 如何搜索靶标 DNA，并制备可以用于 Cas3 酶切割的 DNA 的关键步骤；•研究结果揭示了防止意外基因组损伤发生的多层错误检测机制；•这项研究为提高 CRISPR 系统基因编辑的准确性提供了结构性理解，这将能有助于减少脱靶效应。
CRISPR-Cas3 系统
CRISPR-Cas 获得性免疫系统大体上可以分为三个主要类型和 11 个亚型类型。I 型 CRISPR-Cas 系统包含 Cas3 蛋白。II 型以 Cas9 为标志蛋白。Ⅲ型 CRISPR-Cas 系统又被分为 2 个亚型：ⅢA 和ⅢB，具有标志蛋白 Cas6。I 型 CRISPR-Cas 系统存在于细菌和古细菌中，入侵的外源 DNA 被 cascade-crRNA 复合物识别，cascade-crRNA 复合物沿着序列进行扫描，最终特异性结合在一个含有 PAM 元件（NGG）的位点，crRNA 的前 6 -12nt 对靶位点结合至关重要，随后 Cas3 核酸酶切割目标 DNA，这需要 ATP 和 Mg2+ 参与。
2012 年，由多伦多大学 Alan R. Davidson 和 Karen L. Maxwell 领导的研究小组，在 Nature 杂志上发表研究论文，第一次证实一些基因介导了对 CRISPR/Cas 系统的抑制作用。他们在感染绿脓杆菌的细菌噬菌体中发现了 5 个不同的 I - F 型 “anti-CRISPR”基因。指出噬菌体编码的这些 anti-CRISPR 有可能代表了噬菌体战胜非常普遍的 CRISPR/Cas 系统的一种广泛的机制。
在发表于 2015 年 9 月的 Nature 研究论文中，这一多伦多大学研究小组公布三种 anti-CRISPR 蛋白：AcrF1、AcrF2 和 AcrF3 的功能机制。证实每一个 anti-CRISPR 蛋白都通过不同的机制来抑制了 CRISPR–Cas 的活性。第三种 anti-CRISPR 蛋白 AcrF3 通过结合 Cas3 解螺旋酶 - 核酸酶，阻止其招募到结合 DNA 的 CRISPR–Cas 复合物上来起作用。在体内，这一 anti-CRISPR 可以将 CRISPR–Cas 系统转变为转录遏制物，首次证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控 CRISPR–Cas 活性。
因此可以说作为 CRISPR-Cas 系统的亚型，CRISPR-Cas3 是生物医学研究中广泛应用的精密基因编辑分子工具。然而，在其作用机制方面，特别是如何捕获靶 DNA，目前尚不清楚，而且目前存在的意外脱靶问题也是阻隔这一系统在临床上应用的拦路虎。
CRISPR-Cas3 结构揭示其精确切割过程
在这篇文章中，研究人员利用生化技术和冷冻电子显微镜技术，得到了不同的功能状态下的稳定复合物结构，观察到了 CRISPR 复合物靶向目标 DNA 链，并准备通过 Cas3 酶切割 DNA 的全过程。研究人员表示这些结构有助于揭示多层错误检测的过程，这一过程可以防止出现意外的基因组损伤。
文章作者之一，哈佛医学院助理教授 Maofu Liao 表示，“要解决特异性这个问题，我们需要了解 CRISPR 复合物形成的每一个关键步骤。这项研究报道了 CRISPR 如何捕获 DNA 的准确机制，包括从初始识别靶标 DNA，到构象变化的全过程，这样 DNA 就可以通过 Cas3 进行最终切割了。”
研究人员还发现在 CRISPR-Cas3 中，crRNA 被添加到 CRISPR 蛋白复合物上，当 CRISPR 复合物发现 PAM 序列，就会让 DNA 呈锐角弯曲，迫使一小段 DNA 解链。这允许 crRNA 的一个长 11nt 的片段结合到靶 DNA 链上，形成“seed bubble”。这个结构能起到自动防故障装置的作用，检查靶 DNA 是否匹配 crRNA，如果它们正确匹配，则气泡扩大，并且其余的 crRNA 与其相应的靶 DNA 结合，形成所谓的“R- 环”结构。
一旦这种 R 环完全形成，这种 CRISPR 复合体就发生构象变化，将靶标 DNA 锁定。同时也让 DNA 的第二条非靶标链形成一个凸起，这样形成完整的 R - 环结构，就能被 Cas3 酶切割。
原文检索：
Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System
