Nature牛文剖析细胞焦亡中“破膜”裂解的真相

前期小编已经报道邵峰组炎性介质引起的焦亡，当激活焦亡发生的路径时GSDMD蛋白被切割成N残基片段GSDMD-NT以及炎性细胞因子如白介素1β的释放，但是没有明确的表明GSDMD-NT是如何引起细胞焦亡的，这期小编就继续介绍由波士顿医学院研究报道的GSDMD-NT在细胞焦亡发生了怎样的机制。如题： 《Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores》（回复 170724 可下载文献，一周有效）

假设（一）：在细胞焦亡发生的时候，GSDMD-NT能够在细胞膜上形成孔

第一： 检查GSDMD-NT能否形成低聚化的小分子。 在293T细胞内过表达Flag标签的GSDMD-NT 和GSDMD（小鼠属性的），通过SDS电泳凝胶分析溶解产物并用Flag抗体观察表达情况。结果显示GSDMD-NT在25kDa 和250 kDa之间徘徊，GSDMD具有单体和二聚体，表明其可以形成小分子的低聚物，而当用非变形电泳凝胶观察时，转染Flag-GSDMD-NT的组会有高分子量低聚物出现。

第二： 验证多样化GSDMD亚基在低聚物时的状态。 课题组在HEK293T细胞内分别转染了Flag和HA标签的GSDMD-NT，用Flag和HA抗体做IP都能够沉淀出GSDMD-NT，表明GSDMD-NT自我关联并可能形成同源低聚物；当转染Flag-GSDMD-NT，Flag-GSDMD-CT，共转或者单转GSDMD-CT-MYC在细胞内时，发现GSDMD-CT的没有被Flag抗体共同沉淀下来，但是Flag标记的GSDMD-NT与MYC标记的GSDMD-CT被沉淀下来并相互关联。

第三：已有报道炎性介质caspase11引起细胞焦亡，那么本文就来验证该 c aspase11 引起细胞焦亡时是否激活了GADMD的切割和低聚化。

在293T细胞内，转染Flag-GSDMD和酶致死（C254A）的caspase-11或者未处理的caspase-11，之后通过检测乳酸脱氢酶的释放以及蛋白情况观察GSDMD的低聚化。当过表达Flag–GSDMD和未处理的caspase-11时，细胞有60%死亡，而且只有野生型caspase-11处理的组产生了GSDMD-NT片段和低聚化。同样的结果也出现了在骨髓巨噬细胞iBMDMs细胞系中稳定表达Flag-GSDMD并且电转脂多糖（LPS）的时候激活caspase-11炎性焦亡通路。

假设（二）：GSDMD-NT低聚物通过形成细胞膜孔来杀死细胞

形成膜孔的蛋白通常是带有正电荷膜插入的双性结构，为了验证潜在的功能性膜结构域，课题组在GSDMD-NT中寻找进化保守的，带正电的残基。比较和筛选六种哺乳动物的序列，并使用Clustal Omega 和SOPMA两种软件预测这种膜结构域，有四种出现。因为这四种可能存在很大的重要性，课题组将这4种序列突变，称为4A。

为观察这些突变是否会影响寡聚化和细胞焦亡，课题组在HEK293T细胞分别表达GSDMD，野生型或4A突变型的GSDMD-NT时，结果表明野生型的GSDMD-NT引发了寡聚化和细胞焦亡：4A突变型阻止了GSDMD-NT低聚化和细胞焦亡。 因此结果显示低聚化和细胞焦亡是相关联的，当低聚化发生的同时，细胞也发生了焦亡。

假设（三）：如果GSDMD-NT在细胞膜上形成了小孔，那么其应该在炎性激活以后定位在细胞膜上

为了分析膜定位，课题组将细胞共转了野生型或4A突变型Flag-GSDMD和野生型或者C254A caspase-11，提取膜蛋白，结果发现只有野生型caspase-11会切割出GSDMD-NT片段，也是仅有野生型标记GSDMD-NT被划分为detergent期并与细胞膜相关联。

第一： 为探索GSDMD-NT与何种细胞膜相关联 ，课题组分级收集了细胞核提取后的上清液，该 HEK293T细胞分别被转染Flag–GSDMD，野生型或4A突变型Flag-GSDMD-NT表达质粒，分层次的上清液有细胞溶质的，重膜，轻膜，不溶性细胞质分数，分别称为S100，p7，p20，p100。

结果显示Flag-GSDMD-NT分布在S100和P7。 细胞溶质上包含大部分的单体的Flag–GSDMD-NT，只有膜片段包含高分子量低聚物。

第二：因为脂质结合会影响让蛋白通透的膜小孔的形成，因此课题组 探索可能与GSDMD-NT结合的脂质是什么， 课题组分别孵育重组了 GSDMD，GSDMD-NT，GSDMD-CT 和 4A 突变GSDMD-NT，细胞毒性淋巴细胞成孔蛋白、穿孔素和粒溶解素以及不同脂肪膜。结果显示GSDMD-NT可以与线粒体和细菌的脂质以及心磷脂紧密结合，而与质膜上重要的磷脂酰胆碱（PC）与磷脂酰乙醇胺(PE)不结合。而心磷脂在线粒体的内膜上是不能运输到细胞质中的。

这个脂质结合模式表明GSDMD-NT可能选择性地与质膜的内膜以及与细菌的膜结合。 而外叶上的内体和吞噬小体包含着与内叶同样的磷脂，表明GSDMD-NT可能也与这些相结合。

假设（四）：细胞焦亡时GSDMD-NT形成低聚物并且与PS质膜相关

第一：课题组接下来利用电子显微镜 观察GSDMD-NT低聚物与PS质膜间的关系 ，将PS脂质体与DSDMD在细胞内孵育，以及PS脂质体与DSDMD和Caspase-11共同孵育，结果表明含有Caspase-11细胞膜发生破裂，而仅含有DSDMD的没有膜破裂的现象。

第二：焦亡的细胞还会释放细胞因子的成分到周围环境中，所以课题组观察了过表达 Flag–GSDMD-NT 后，会不会释放GSDMD-NT 到培养基中。结果显示Flag–GSDMD只在细胞中高表达，而Flag–GSDMD-NT 在上清液中表达。

为了检测释放的GSDMD-NT的活性，课题组将上清液放入 iBMDM细胞中孵育，结果显示没有细胞发生焦亡，并且用凋亡染色进一步得到了同样的结果验证。这些证据表明 GSDMD-NT 不会从细胞膜外破坏细胞的活性，因此其只会与细胞膜的内叶上的脂质相结合，从而影响细胞的活性。

以上便是波士顿医学院关于细胞膜实验的主要部分，怎么样？有没有学到细胞膜实验的精髓，是不是感慨于国外实验室对实验内容的精细处理。

为此小编这期就细胞膜知识给大家做一点点的普及：

细胞膜的化学组成：主要组成成份是膜脂、膜蛋白质、膜糖。其中膜脂是构成细胞膜的结构骨架，而膜蛋白质则以多种形式与脂分子双层结合，膜糖类则覆盖在细胞膜的表面。

细胞膜的生物学特性：细胞膜的不对称性、细胞膜的流动性、膜蛋白的运动性。其中细胞膜的不对称性决定膜功能的方向性，而细胞膜的流动性是膜功能的保证，膜蛋白则可以进行侧向扩散，翻转，旋转等运动。