在《Nature》期刊发表的这篇文章中，比利时的科研团队探讨了SPO11蛋白在体外催化DNA双链断裂(DSBs)的机制。SPO11是启动减数分裂重组的关键蛋白，通过诱导程序性DNA双链断裂来实现。然而，SPO11的这种催化活性此前从未在体外重建过。研究者们利用小鼠SPO11建立了一个生化系统，成功再现了减数分裂DSB形成的所有特征。他们发现，SPO11在没有任何伴侣蛋白的情况下即可催化DNA断裂，并且在断裂后仍然与5′断裂链共价结合。SPO11的目标位点选择受DNA底物的序列、可弯曲性和拓扑结构的影响。此外，SPO11在溶液中以单体形式存在，但其切割活性需要二聚化以重建两个混合活性位点。SPO11与其伴侣TOP6BL形成1:1复合物，催化DNA切割的活性与单独的SPO11相似，但该复合物对DNA末端的亲和力更高，暗示其在切割后的潜在作用。研究者提出了一种模型，认为SPO11在体内需要其他伴侣蛋白的参与，这些伴侣蛋白通过组装生物分子凝聚体来招募SPO11-TOP6BL，从而实现二聚化和切割。此研究确立了SPO11二聚化是控制减数分裂DSB诱导的基本机制。
SPO11是一种关键的酶，负责在减数分裂过程中引发DNA双链断裂（DSBs），从而启动重组。然而，尽管SPO11在体内的活性已被广泛研究，其在体外的催化活性一直难以重现，这限制了对其机制和调控的深入理解。SPO11起源于一种异四聚体（A2B2）型IIB拓扑异构酶VI的DNA切割亚基，与拓扑异构酶VI类似，SPO11通过活性位点酪氨酸对DNA骨架进行亲核攻击，产生带有两个核苷酸5′突出端的断裂。然而，与拓扑异构酶VI不同，SPO11在体内的切割活性依赖于一个类似于拓扑异构酶VIB的亚基（TOP6BL）及一系列附加因子。在小鼠中，这些因子包括减数分裂特异性伙伴REC114、MEI4、MEI1和IHO1（RMMI）。尽管如此，由于缺乏重建的系统，SPO11活性的控制机制及其伙伴的功能仍然未知。
本研究首次在体外重建了小鼠SPO11的DNA双链断裂形成，展示了SPO11在没有任何伙伴的情况下能够催化断裂的形成，并且仍然与5′断裂链共价结合。研究还发现，SPO11的目标位点选择受到DNA底物序列、可弯曲性和拓扑结构的影响，并提供了SPO11能够重新封闭单链DNA断裂的证据。此外，研究表明SPO11在溶液中是单体，切割需要二聚化以重建两个混合活性位点。SPO11与其伙伴TOP6BL形成1:1复合物，催化DNA切割的活性与单独的SPO11相似，但该复合物对DNA末端的结合亲和力更高，暗示其在切割后可能的角色。研究提出了一种模型，SPO11在体内需要额外的伙伴来组装生物分子凝聚体，这些凝聚体招募SPO11–TOP6BL，促进二聚化和切割。研究确立了SPO11二聚化作为控制减数分裂DSBs诱导的基本机制。
研究团队成功在体外重建了小鼠SPO11蛋白的DNA双链断裂（DSB）催化活性，展示了SPO11在没有其他蛋白质伙伴的情况下能够催化DNA断裂，并且在断裂后仍然共价结合在5' DNA断裂端上。研究发现SPO11的目标位点选择受到DNA底物的序列、可弯曲性和拓扑结构的影响。此外，SPO11在溶液中是单体形式，但需要二聚化以形成两个混合活性位点来进行DNA切割。SPO11与其伙伴TOP6BL形成1:1复合物，该复合物与SPO11单独存在时具有相似的DNA切割活性，但对DNA末端的结合亲和力更高，暗示其可能在切割后的作用。
研究还提出了一个模型，认为SPO11在体内需要其他伙伴蛋白的参与来形成生物分子凝聚体，从而招募SPO11-TOP6BL复合物，促进其二聚化和切割。研究表明，SPO11的二聚化是控制减数分裂DSB诱导的基本机制。
1. 理解减数分裂重组机制：研究揭示了SPO11在体外能够单独催化DNA双链断裂，这对理解减数分裂重组的基本机制具有重要意义。了解SPO11的作用机制有助于更好地理解遗传多样性形成的分子基础。
2. 改善不孕不育治疗策略：由于SPO11在减数分裂中的关键作用，这项研究可能对改善与减数分裂相关的不孕不育问题提供新的思路。通过了解SPO11的功能和调控机制，可以开发出新的治疗策略，提高生育能力。
3. 遗传病研究：SPO11功能异常可能导致染色体畸变，从而引发遗传疾病。深入研究其作用机制有助于识别和理解这些疾病的发生机制，并可能为疾病的早期诊断和干预提供靶点。
4. 促进生物技术应用：了解SPO11的催化机制可以促进基因编辑技术的发展，特别是在需要引入特定DNA断裂的应用中，如精准基因组编辑中诱导特定位点的断裂。
1. SPO11的纯化与活性检测： 从感染了杆状病毒的昆虫细胞中纯化带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的小鼠SPO11。 通过离子交换柱分离并在存在质粒DNA和二价金属离子（如Mn²⁺和Mg²⁺）的条件下进行DNA切割反应。 使用EDTA和SDS终止反应，并用蛋白酶K去蛋白化后进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. DNA切割的验证： 使用各种方法（如酚-氯仿分配、酶切耐受性测试等）验证SPO11在DNA断裂后仍然与5'末端共价结合。 通过突变实验（如Y137F/Y138F）确认活性位点的关键氨基酸。
3. 切割位点和底物特异性： 研究SPO11对不同DNA底物（如质粒、含Widom 601序列的DNA）的切割偏好。 使用限制性内切酶和DNA弯曲性预测工具（DNAcycP）分析DNA的结构特征对SPO11切割的影响。
4. SPO11的二聚化与活性位点重构：使用混合突变体实验（如Y137F/Y138F与E224A）验证活性位点的重建需要SPO11的二聚化。通过SEC-MALS分析SPO11的单体和二聚体状态，结合DNA结合实验，探讨DNA结合对SPO11二聚化和切割活性的影响。
5. SPO11-TOP6BL复合物的研究：使用AlphaFold 3模型研究SPO11-TOP6BL复合物的结构特征，并进行DNA结合与切割实验。
图1：小鼠SPO11蛋白的纯化方案
Figure 1 展示了小鼠SPO11蛋白的纯化过程及其在体外DNA切割实验中的活性分析。A. 通过SDS-PAGE分析纯化的MBP-SPO11的离子交换组分，作者展示了不同组分中SPO11蛋白的纯化效果。B. 体外DNA切割实验的方案图，展示了样品在蛋白酶K处理后的产物。C. 使用从B中获得的SPO11组分在二价金属离子（Mg2+和Mn2+）存在下进行质粒DNA切割分析，结果显示了质粒二聚体的形成，标记为星号的条带对应于质粒二聚体。D. 通过分析活性位点导向的双突变Y137F/Y138F（YFYF/）对SPO11 DNA切割活性的影响，发现该突变显著降低了SPO11的DNA切割活性。E. 研究了SPO11 DNA切割活性对二价金属离子的需求，结果表明SPO11的DNA切割活性需要二价金属离子的存在。结论：该图展示了小鼠SPO11蛋白的纯化过程及其在体外DNA切割实验中的活性，强调了SPO11的DNA切割活性需要二价金属离子的参与，并且活性位点的突变会显著影响其功能。
图2：预测在b-e中的验证
Figure 2 旨在验证SPO11蛋白在DNA切割过程中的作用机制，特别是其与DNA的共价结合及其对不同处理的反应。B. 为了分析DNA切割产物在有无蛋白酶K处理下的变化，作者进行了琼脂糖凝胶电泳分析。所有反应均用SDS处理以消除非共价结合。结果显示，蛋白酶K处理前后，DNA切割产物的电泳图谱存在差异，表明蛋白酶K处理影响了DNA与蛋白的结合状态。C. 作者对野生型和突变型SPO11的DNA切割产物进行了苯酚-氯仿分配实验，观察蛋白酶K处理前后DNA切割产物的变化。结果显示，蛋白酶K处理影响了DNA切割产物在苯酚提取前的状态，提示SPO11与DNA的结合可能是共价的。D. 通过分析EcoRI和SPO11依赖的切割产物对5′–3′外切酶T5 Exo的抗性，作者发现SPO11依赖的切割产物对T5 Exo具有抗性，表明SPO11可能通过共价结合保护DNA末端。E. 使用SDS-PAGE分析了野生型或突变型SPO11（YFYF）在3′或5′荧光标记的80 bp底物存在下的共价SPO11–DNA复合物。结果表明，SPO11与DNA形成了共价复合物，并且这种结合在不同的底物标记位置下表现出不同的电泳迁移率。结论：图2的实验结果支持了SPO11与DNA形成共价结合的假设，并揭示了这种结合在DNA切割过程中的重要性。
图3：使用5′放射性标记的80bp底物进行DNA切割反应的测序凝胶分析
Figure 3 旨在分析SPO11对DNA底物的切割位点及其影响因素，包括DNA拓扑结构对SPO11依赖性切割速率的影响。A. 为了分析DNA底物的切割位点，作者使用限制性内切酶对底物进行消化（图中第2和第6泳道），并通过测序凝胶分析展示了切割结果。结果显示，限制性内切酶能够在特定位点切割DNA底物。B. 为了展示DNase I对DNA底物的部分消化效果，作者进行了部分消化实验（图中第3和第7泳道）。结果表明，DNase I能够在多个位点进行非特异性切割。C. 为了确定SPO11的切割位点，作者在图中第4和第8泳道中标记了SPO11的切割位点，并用橙色箭头标出。结果显示，SPO11在特定位点进行切割，且这些位点在二面体轴±3的位置上。D. 为了分析标准质粒底物（pCCB959）上SPO11的切割位点，作者通过限制性消化分析了SPO11反应产物。结果表明，SPO11在质粒底物上存在优先切割位点，并用箭头标出。E. 为了研究含有24个Widom 601序列的质粒底物（pOC157）上SPO11的切割位点，作者进行了分析。结果显示，Widom 601序列影响了SPO11的切割位点分布。F. 为了探讨DNA拓扑结构对SPO11依赖性切割速率的影响，作者进行了定量分析，结果显示DNA拓扑结构显著影响了SPO11的切割速率。G. 为了预测质粒底物的环化能力（C-score），作者使用DNAcycP进行了预测。结果表明，质粒底物的特定位置具有较高的环化能力。H. 为了展示SPO11二聚体与40bp双链DNA底物结合的结构，作者使用AlphaFold 3模型进行了模拟。结果显示，Mg2+离子（以洋红色显示）参与了结合，且标记了形成5′悬垂末端的核苷酸（+1和+2）。结论：SPO11在特定位点进行DNA切割，其切割位点和速率受DNA序列和拓扑结构的影响。模型预测显示SPO11与DNA的结合涉及特定离子和核苷酸位置。
Figure 4 展示了SPO11的结构域、二聚体排列以及其活性位点的细节。A. 图中展示了SPO11的结构域结构及其二聚体的排列。通过AlphaFold 3模型，作者对结合DNA的SPO11二聚体的复合活性位点进行了放大观察。图中标记了Mg2+离子（A和B）以及活性位点残基和可切割的磷酸基团（P）。B. 为了分析SPO11的切割活性，作者对两种催化失活突变体的混合物进行了时间过程分析。通过SEC–MALS（尺寸排阻色谱-多角度光散射）分析了MBP–SPO11在淀粉亲和纯化后的状态。蓝色曲线表示从尺寸排阻色谱中获得的280 nm吸光度测量值；红色曲线表示在峰值范围内的分子质量测量。最左侧的峰可能对应于二聚体，尽管无法确定其分子质量；最右侧的峰对应于一个截短的片段。C. 在恒定浓度的SPO11下进行DNA滴定实验，反应在15分钟后停止。定量结果显示了两次独立实验的均值和范围。D. 对野生型和催化失活的SPO11在不同浓度下的切割活性进行了时间过程分析。结论：通过对SPO11的结构域、二聚体排列及其活性位点的详细分析，结合对其催化活性的实验研究，揭示了SPO11在DNA双链断裂过程中的功能特性。
