Plus深读 | Mol Cell: Mll3\/4催化的H3K4me1对增强子活性不必要

组蛋白修饰H3K4me1和H3K27ac一直被认为是活化态增强子（active enhancer）的重要标记。其中，增强子H3K4me1主要被甲基转移酶Mll3和Mll4催化。但斯坦福大学的Joanna Wysocka课题组发现，mESC的活化态增强子的H3K4me1对eRNA和临近基因的转录都不是必要的。Mll3和Mll4对增强子的活化作用并不依赖于其酶活，而是作为转录共激活因子，促进Pol II在增强子和启动子上的加载。文章发表在2017年5月18日的Molecular Cell上。

原文链接：

http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2017.04.018

增强子是一种重要的顺式转录元件，活化的增强子的染色质开放度高，结合了很多转录因子，转录共激活因子和RNA Pol II，会激活靶基因的表达。通过对多个物种和大量组织的研究发现，增强子的染色质上经常出现H3K4me1，其中，活化态的增强子上常有H3K4me1和H3K27ac共定位；而只有H3K4me1，没有H3K27ac（有些有H3K27me3）的增强子则是沉默态或poised/primed增强子。增强子活性的变化过程经常伴随着这些组蛋白修饰的变化，在细胞分化、细胞癌变等细胞命运变化的过程中，发挥调控作用。

(有关增强子的相关研究，可参考：

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【Plus深读】Nature Comm：原发性胃癌的超级增强子异质性分析 ）

其中，增强子上的H3K27ac可以招募阅读蛋白BRD4，进而招募Mediators和Pol II，激活靶基因。而H3K4me1在增强子上的功能，仍不明确。

哺乳动物的H3K4me可以被MLL1-MLL5, SET1A, SET1B催化形成。之前的研究发现，Mll3（又叫Kmt2c, HALR）和Mll4（又叫Mll2, Kmt2d, ALR）结合在增强子上，催化H3K4me1 ^[1-3] ，并招募转录共激活因子p300催化产生组蛋白乙酰化，激活增强子 ^[2-4] 。Mll3/4缺失会下调增强子活性。基于此，人们普遍认为H3K4me1可调控增强子及其靶基因的活性。

而Joanna Wysocka课题组在mESC中突变Mll3和Mll4的酶活中心，使其不能催化增强子H3K4me1，却发现增强子及靶基因活性几乎不变（增强子H3K27ac略微下调）。但双敲除Mll3/4，则会引起H3K27ac的明显下调，eRNA及附近基因转录活性的显著下降。因此，作者认为， Mll3/4激活增强子的作用与其催化H3K4me1的活性无关。

首先，作者构建了Mll3/4双敲除（记为dKO）和Mll3 Y4792A, Mll4 Y5477A双酶活突变（记为dCD）的mESC细胞系。（研究者也曾构建切除C端SET结构域的Mll3/Mll4细胞系，但发现这会引起蛋白质不稳定，使得western blot检测不到MLL3/4蛋白。所有的Mll3/4WT及突变结构示意图见图1B。）在WT mESC中，约30%的组蛋白含有H3K4me1修饰，而H3K4me2占约1.4%，H3K4me3约占0.35%。Mll3/4 dKO或dCD会引起H3K4me1下降一倍到15%，而H3K4me2和H3K4me3没有显著变化（图1A）。dCD不影响Mll3/4的蛋白量（图1C），也不影响Mll3/4与UTX和Rbbp5的相互作用（图1D）。dCD不影响Mll3/4在增强子上的定位（图1E），这些增强子在WT mESC中存在H3K4me1, H3K27ac, Pol II的共定位，并且有nascent RNA的转录，他们和Mll3/4的结合正相关。Promoter上的Mll3/4结合较弱，H3K4me1信号也较弱，有Mll2，H3K4me3, H3K27ac, Pol II的共结合，以及nascent RNA的转录（图1F）。

图 1 确认Mll3/4 酶活突变(dCD)及双敲除(dKO)的mESC细胞系构建成功

下一步，研究者检测了Mll3/4双酶活突变(dCD)和Mll3/4双敲除(dKO)对增强子组蛋白修饰的影响。他们发现，dCD和dKO都会使得Mll3/4结合的增强子的H3K4me1降低（其中dCD比dKO更能引起Mll3/4 结合的增强子H3K4me1降低，分析讨论详见延伸思考）；而对于H3K27ac来说，dCD只能引起H3K27ac微弱下调，dKO却能引起H3K27ac显著下降。UCSC genome browser tracks见图2A；热图见图2B~2F；Mll3/4结合的增强子的H3K4me1和H3K27ac下降见图2D，图2G；Mll3/4不结合的增强子的H3K4me1和H3K27ac在dCD和dKO中几乎不变，见图2E，图2H。

图 2 Mll3/4突变对增强子经典组蛋白修饰的影响

研究者发现，敲除Mll3/4后，会使Mll3/4结合启动子的基因，以及Mll3/4结合增强子附近5kb的基因的表达下调（图3A，3C）。但Mll3/4酶活突变体则对这些基因影响不大（图3B，3D）。Pol II ChIP-seq发现，WT mESC中，在Mll3/4结合的增强子上，Pol II和Mll3/4共富集。dKO会使得Pol II在这些位点的结合明显下降，而dCD则不会产生影响（图3D，3F）。在Mll3/4不结合的增强子上，Mll3/4 dKO和dCD对Pol II的加载都不影响（图3G）。这说明Mll3/4的蛋白对靶基因的转录，以及增强子的活性是必要的，但其酶活不是必要的。

图 3 Mll3/4双敲除会引起靶基因转录下调和增强子Pol II加载，但Mll3/4酶活突变不会。

研究者在增强子上，进行了start-seq（检测eRNA的技术：将细胞核的小RNA提取出来，去掉cap，分正负链建库测序），发现Mll3/4结合的增强子的正负链eRNA，在dKO中明显下调（图4A, 4C），但dCD对这些eRNA无影响（图4A）。在Mll3/4不结合的增强子上，dKO和dCD都对正负链eRNA没有明显影响（图4B）。这说明Mll3/4的蛋白对其结合的增强子的活性是必要的，但Mll3/4的酶活并不必要。

然后，研究者检测了Mll3/4 dKO对Mll3/4结合增强子的临近基因的转录的影响。研究发现，Mll3/4 dKO虽然不太影响临近基因的Pol II在启动子上的加载（图4E, 4G, 4H），但却使得Pol II难以延伸到genebody中去（图4I），从而下调了临近基因的转录（图4F）。dCD对Pol II在genebody的延伸无影响（图J）。这说明增强子的Mll3/4蛋白对附近基因的Pol II释放到genebody中是必要的。但其酶活不是必要的。

图 4 增强子Mll3/4对eRNA和临近基因的转录是必要的，但不依赖于酶活。

1. 活化态增强子经常被H3K4me1和H3K27ac标记，H3K4me1的甲基转移酶Mll3/4又的确介导了活化态增强子的产生，因此，人们普遍认为H3K4me1可调控增强子及其靶基因的活性。而本文发现了Mll3/4激活增强子的作用与其催化H3K4me1的活性无关，H3K4me1对于活化态增强子的活性不是必须的。 这提醒我们需要注意这些酶类转录共激活因子的 非酶活依赖的作用。 并且蛋白或表观修饰在基因组上的 共定位，不代表他们之间存在调控关系。

2. 有关Mll3/4在增强子活化过程中的作用，NIH的戈凯课题组利用脂肪细胞分化模型，做出了很详细的工作。他们的研究发现，脂肪前体细胞分化为脂肪细胞的过程中，pioneering factor PPARγ, CEBPα/β首先结合到分化时需要被激活的增强子上，招募MLL3/4, 加上H3K4me1, 并开打染色质。MLL3/4招募p300到染色质上，加上H3K27ac，招募H3K27ac阅读器BRD4。BRD4招募增强子蛋白复合物Mediators，Mediators结合更多转录因子/转录共激活因子和Pol II，产生eRNA 转录及附近的脂肪分化相关基因转录。 ^[3,5]

   可以看到，MLL3/4蛋白在增强子激活过程中的非酶活作用的确很重要。

3. MLL3/4在分化发育过程中扮演了重要角色，MLL3/4对脂肪，肌肉，乳腺，B细胞，T细胞，心脏，精子等多类细胞的发育都是必要的。戈凯课题组的研究也发现，Mll3/4对体细胞重编程为iPSC，以及mESC向三个胚层的方向分化，都是必要的。但Mll3/4敲除不影响mESC的生长维持。 ^[3,6]

   而本文的研究中，并没有检测Mll3/4的酶活对mESC的分化是不是必要的。有可能H3K4me1对 已经活化的增强子的活性 维持不重要（因为H3K27ac已经在那里了）。但 在细胞命运改变的过程 中，H3K4me1在增强子上的建立可能是有重要作用的。

4. 按照以上模型，Mll3/4主要在活化态增强子上起作用。但还有很多增强子并不处于活化态，很多增强子上只有H3K4me1，没有H3K27ac，有些还有抑制性的标记H3K27me3。这些增强子有些在分化后才会被激活，有些在分化后会被完全抑制。这些增强子提供了不同细胞分化方向的可能性。那么这些增强子上的H3K4me1是否有作用，有什么作用，是谁催化的，都还有待研究。

   值得注意的是，在图2B,2C中，可以看到在Mll3/4结合较弱的增强子上，Mll3/4 dCD或dKO都会引起其H3K4me1上升；在Mll3/4结合最强的增强子上，dKO后仍保留着部分的H3K4me1. 这表明还有其他甲基化酶参与催化增强子H3K4me1，但并不会引起H3K27ac明显上升，该酶可能会代偿或竞争Mll3/4的作用。

5. 我们仍不清楚增强子为何有 H3K4me1 的标记。

6. 本文只研究了Mll3/4结合的增强子对附近基因的转录调控的作用，发现Mll3/4催化的H3K4me1对附近基因的转录激活没有明显作用，但他们并未检测这些增强子对远端的靶基因调控是否受H3K4me1的影响。

7. 本文无法回答增强子 eRNA 的产生与靶基因转录之间的关系。 Mll3/4 dKO 同时影响了增强子上的 Pol II machinery ， eRNA 转录信号，以及 eRNA 分子。目前还未确认这三者在调控靶基因转录中的具体作用。