复旦大学李庆团队EST｜体外人源支气管上皮细胞系和气道类器官研究元素碳在PM诱导呼吸毒性中的作用

生态环境科学 · 公众号 · · 2024-12-31 08:30

正文

转自：ENV. One Health

Absence of a Causal Link between Elemental Carbon Exposure and Short-Term Respiratory Toxicity in Human-Derived Organoids and Cellular Models

人源类器官和细胞模型中元素碳暴露与短期呼吸毒性之间不存在因果关系

通讯作者：李庆教授复旦大学

大气中的黑碳或元素碳（ elemental carbon， EC）的急性呼吸毒性作用仍不清楚。本研究使用体外气道类器官和细胞系评估了EC对细颗粒物（PM2.5）对人类呼吸道的短期毒性（包括细胞毒性和氧化应激效力）的贡献。每单位质量的EC（包括炭和烟尘）的毒性比不完全燃烧产生的多环芳烃（PAHs）低2个数量级以上。EC对PM2.5毒性的贡献比多环芳烃低约1个数量级，尽管它与PM2.5诱导的毒性呈正相关（p<0.0001）。此外， PAHs分别占固体和液体燃料典型不完全燃烧排放的PM2.5总毒性的71.9±12.2%和61.9±32.8% ，而PM2.5毒性与多环芳烃含量显著相关（r=0.94，p=0.002）。因此， EC不是诱发急性毒性的原因，这可能归因于多环芳烃的共同排放。这些发现为理解与接触PM2.5相关的呼吸系统健康风险提供了因果证据，并进一步有利于制定有效的空气污染控制政策。

Synopsis

The apparent contribution of elemental carbon to aerosol toxicity in the atmosphere was attributed to coemitted organics from incomplete combustion, including PAHs.

元素碳对大气气溶胶毒性的贡献归因于不完全燃烧产生的有机物，包括多环芳烃。

元素碳（EC）是大气颗粒物（PM）的主要成分，已被认为对人类健康有相当大的负面影响。大气EC主要来源于不完全燃烧，如固体燃料和柴油车的住宅燃烧。这些EC相关燃烧源排放的PM与心血管疾病风险升高密切相关。此外，与未分化的环境PM相比，EC与不良健康结果表现出强烈的相关性，包括全因死亡率、住院率以及与呼吸系统和心血管疾病相关的死亡率增加。尽管这些流行病学研究为EC的高毒性提供了令人信服的证据，但毒理学研究仍缺乏直接和系统的证据来证实这些致病联系。

根据形成过程，PM结合的EC分为炭和烟尘。炭通常由碳基材料热解后的固体残渣形成，而烟尘通常是通过高温不完全燃烧过程中气态有机物的成核形成的，通常涉及多环芳烃（PAHs）。直接从PM样品中分离纯炭和烟尘仍然具有挑战性，因为它们普遍与共排放的PAHs和其他衍生物结合在一起。因此，在不区分炭和烟尘形式的情况下，使用含有有毒物质或单一结构样材料的不纯EC样品来证明EC在暴露实验中的毒性作用。炭黑作为烟尘的替代品对某些毒性终点有明确的影响，如炎症反应和氧化应激（OS）。然而，由于其溶解性差和毒性低，炭黑已被证明可诱导动物患癌症，但仅在极高的持续暴露水平下。结果证实，在体外细胞模型中，烟尘只能对细胞存活和生长及其OS效应产生微弱的毒性作用。同样，之前对炭黑生产工人的职业暴露调查显示，炭黑暴露与癌症风险之间没有正相关关系。相比之下，作为各种污染物的载体，特定炭的毒性很少被研究，尽管它可能具有毒性和健康益处。毒理学和流行病学研究中的现有证据仍然不足以证实EC引起的毒性或健康影响，因为结果仍然不一致。因此，暴露于EC的毒性影响，包括烟尘和焦炭，仍需得到充分解决。

本研究通过体外人源支气管上皮细胞系和气道类器官毒理学试验，为阐明EC在PM诱导的呼吸毒性中的作用提供了直接的毒理学证据。对在农村和城市大气以及典型的EC相关排放源中收集的炭和烟尘以及PM2.5（空气动力学直径小于2.5μm的PM）样本的毒性，包括细胞毒性（CT）和OS效应进行了估算。进一步分析了烟尘/炭和多环芳烃对来源和大气PM2.5毒性的贡献。所获得的结果可能有助于填补目前毒理学数据的空白，深入了解EC与其不良健康结果之间的联系。

图1 特定EC/PHS的毒性及其对环境PM毒性的贡献。暴露于EC（炭和烟尘）、苯并（a）芘（BaP）和标准PM（sPM，NIST 1648a）的BEAS-2b细胞的细胞毒性（a）和氧化应激（b）效力。炭、烟尘、多环芳烃和微量元素对城市PM2.5的平均质量和毒性贡献（从三个城市采样，n=13）（c）。结果表示为来自三个独立实验的平均IC50（相对于对照组引起50%抑制的浓度）和EC1.5（有效诱导细胞内ROS产生的浓度是对照组的1.5倍），每组n=3。较高的EC1.5和IC50值表示较低的毒性。左图中的每个点代表每个独立实验中IC50和EC1.5的平均值。

图2 EC质量含量与PM2.5诱导的毒性之间存在正相关关系。PM诱导的氧化应激（OS，r=0.61，p<0.0001）（a）和细胞毒性（CT，r=0.62，p<0.00001）（b）效力表现出显著的非线性正相关，EC的质量浓度与阴影区域表示95%的置信区间

图3 固体和液体燃料不完全燃烧产生的多环芳烃和EC之间的线性相关性。燃烧典型含碳固体燃料（秸秆、木材、烟煤和无烟煤的住宅燃烧）（a）和液体燃料（以燃油和柴油为燃料的船舶以及柴油和柴油车）（b）排放的PM2.5中的EC和PAHs含量呈现出显著的线性关系（固体燃料r=0.73，p=0.0002；液体燃料r=0.89，p<0.0001）。虚线和灰色阴影分别表示拟合曲线和95%置信区间

图4 来自主要EC相关来源的PM的毒性可归因于EC和PAHs。（a）典型不完全燃烧源（包括生物质、烟煤、无烟煤、船舶和道路柴油车的住宅燃烧）排放的PM2.5的平均EC1.5（有效诱导细胞内ROS产生的浓度是对照组的1.5倍）值的分布；以及这些排放的PM2.5中炭、烟尘和多环芳烃的质量分数（b）和毒性贡献（c）。误差条表示标准误差

图5 多环芳烃和EC与典型燃烧源排放的PM2.5引起的毒性之间存在线性相关性。PM2.5诱导的相对氧化应激（OS）效力（a）与多环芳烃质量浓度呈显著相关性（r=0.94，p=0.0017），而EC没有显著相关性（b）（p=0.15）。每个点代表一个单独的来源，包括固体燃料（包括固体废物、无烟煤、烟煤和生物质）的不完全燃烧、发电厂和液体燃料燃烧（即道路柴油车辆和船舶）。相对OS效力由PM相对于BaP的等效OS效力量化（详细计算见文本S3）。数据以平均值表示，并带有相应的标准误差。深灰色虚线表示拟合曲线

图6 通过气道类器官模型获得的结果验证了EC的低毒性。与船舶、道路柴油车和住宅单元排放的苯并[a]芘（BaP）和PM2.5（Res.）相比。固体燃料的燃烧和EC（炭和烟尘）的暴露对气道类器官（a）和BEAS-2b细胞（b）的影响很小。hAO的暴露后持续时间为3天，BEAS-2b细胞为1天。结果以三个独立实验的平均IC50（相对于对照组引起50%抑制的浓度）表示，每组三个重复。IC50值越高，细胞存活率越低。误差条表示标准误差

图7 EC和PM2.5诱导的毒性之间的非因果关系。EC和健康影响的因果图概述了本研究中提出的五个因果论点（左）。基于“因果阶梯”概念（右），潜在的因果关系，即观察到的EC与健康之间的关联（a），被EC对空气传播和不完全燃烧排放的PM2.5的质量毒性贡献不均（b）以及仅与不完全燃烧源相关的假设PM2.5的毒性与EC浓度之间的正关联（c）所破坏

在本研究中，毒理学实验量化了纯EC的毒性，并揭示了其对空气和特定来源PM2.5样本中PM2.5整体呼吸毒性的贡献。目的是阐明EC和PM引起的不良健康影响之间的关联。 EC，无论是炭还是烟尘，都表现出轻微的毒性，并不作为主要的有毒成分，而是作为EC相关源排放产物的间接指标，主要归因于多环芳烃的共同排放。此外，使用hAO来验证基于体外BEAS-2b细胞系的毒理学结果（图6）。由于hAO密切模仿人类气道组织的形态和功能，它有助于克服单细胞系研究的局限性。结果表明，炭和烟尘比BaP低约2个数量级。此外，来自这些EC相关来源的PM2.5引起的毒性比EC高1个数量级。这些结果与二维细胞系的结果一致。因此，我们的研究提供了令人信服的毒理学证据，表明EC在较宽浓度范围内单独诱导的毒性较弱，这与之前的一项研究结果一致。

确定EC与不良健康结果之间的因果关系迫切需要更系统的毒理学证据。根据我们的毒理学结果，本研究设计了五个潜在的因果（“C→E”）链，即EC和PAHs的不完全燃烧、PAHs到EC、PAH和EC对PM2.5毒性的影响。总的来说，这五条链系统地形成了一个有三层的层次结构，解决了EC是否会对健康产生影响，称为“C2→E1”关系。环境PM2.5引起的毒性随着PM2.5结合EC质量分数的增加而增加，这与流行病学调查的观察结果一致（第1层，观察关联）。然而，EC仅占PM2.5总OS效力的一小部分（1.1%），来源于大气或不完全燃烧排放（第2层，PM2.5诱导的毒性效力分布，如图7b所示）。该值至少比多环芳烃低一个数量级，对OS效力的贡献超过10%。另一个讨论是基于假设的PM2.5，该PM2.5仅来自不完全燃烧排放（第3层，假设关联）。与空气中的PM2.5类似，假设的PM2.5的OS效力与其EC浓度之间存在很强的指数相关性（r=0.84，p<0.0001）。这表明，与毒性的正相关在很大程度上取决于不完全燃烧源的贡献。在之前的研究中观察到不完全燃烧程度与PM毒性之间存在很强的线性关系，为“C1→E1”关系提供了有效证据。此外，与EC共存的多环芳烃主导了不完全燃烧产生的PM2.5的毒性（>60%），大大增加了空气中PM2.5的毒性。这些发现表明，PM中单独的EC不会直接诱导PM的急性毒性。相反，多环芳烃在驱动毒性作用中起着主要作用，建立了“C3→E1”的关系。因此，从毒理学的角度来看，EC与不良健康结果之间的关系应被定义为非因果关系。

本研究存在几个局限性，主要与EC毒性的估计有关。本研究未考虑长期接触EC的慢性毒性和潜在健康风险。由于其不溶性和代谢抗性，长期暴露于大气PM中结合的EC的健康风险可能表现为年龄累积效应，类似于暴露于PM2.5的情况。本研究构建的AO模型具有应用于长期体外暴露研究的潜力，因为它可以进行长期扩展并保持自组织。从体外细胞系中选择的两个毒性终点可能不足以充分评估EC的生物效应。小尺寸的EC颗粒可以穿透空气-血液、血液-大脑和胎盘屏障，可能引发组织特异性或全身性反应。因此，未来的研究应整合体内、体外和人体暴露研究，以评估更广泛的毒性作用，如免疫反应和DNA损伤，建立更全面的“细胞-组织-动物-人类”证据链，以确定EC的毒理学作用。此外，本研究量化了EC和其他目标化学物质的毒性，而不考虑大气老化的影响，这可能会改变PAHs和EC的化学结构，并进一步改变其毒性作用。尽管本研究进行了一些初步尝试，但尚未完全确定EC的间接毒性作用，例如本研究中与其他化学物质的联合作用。因此，需要充分探索EC的健康风险及其与其他活性成分的协同毒性作用。尽管存在这些局限性，但这项研究从毒理学的角度探讨了EC与不良健康影响之间的因果关系。

获得的毒理学结果表明，EC不能被视为环境PM中的直接毒物，而是EC相关来源及其衍生有毒污染物的毒性指标。因此，评估PM可归因健康风险的毒理学和流行病学研究都需要关注多环芳烃和衍生芳烃，特别是在大气中EC浓度升高的地区。此外，环境PM2.5的毒性分析强调了确定其主要贡献成分和机制的必要性，因为超过一半的毒性贡献者仍然未知。我们的毒性结果来自类器官和细胞模型中特定来源的PM暴露，表明在印度等不完全燃烧事件普遍存在的国家和地区，控制不完全燃烧的排放是减轻健康风险的最有效策略之一，例如采用更清洁的燃料并为这些EC相关来源配备后处理技术。

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