点评丨徐华强 研究员 （中国科学院上海药物研究所）磷是构成生命的重要元素之一，其与钙在人体中的含量接近，是仅次于氧、碳、氢、氮的化学存在。磷在生命活动中的角色多种多样，既可以作为分子骨架参与核酸、脂双层膜的形成，又可以高能化学键的形式参与能量存贮与转运，同时还以其灵活的成键方式产生重要的信号分子参与生物途径的调控。在细胞中，磷酸根（包括HPO42-与H2PO4-）是丰度最高的无机阴离子之一，它的浓度直接影响多种生化反应的平衡以及细胞内的pH稳态，因此必须受到严格调节。细胞增殖分裂、细胞内能量储存、羟基磷灰石结晶生成等细胞生物学过程可消耗大量的游离磷酸根，而旺盛的能量代谢则可能大量产生游离磷酸根，这些生命活动的进行势必造成细胞内磷酸浓度的涨落，从而对磷酸稳态造成扰动。为应对这一问题，生命进化出多种位于细胞膜上的磷酸转运蛋白来进行磷酸的摄取与排放。有趣的是，负责内向摄取的磷酸转运蛋白系统具有一定的冗余度，多个溶质转运体家族的蛋白参与其中，包括SLC20A1（PIT1）、SLC20A2（PIT2）、SLC17A1（NPT1）、SLC34A1（NPT2）、SLC34A2（NPT2B）与SLC34A3（NPT2C）等；与之呈对比的是，具备向外排放磷酸功能的转运蛋白目前仅仅发现一种，即SLC53A1，又称为XPR1。XPR1最初作为异嗜与多嗜性逆转录病毒（xenotropic and polytropic retrovirus）的潜在受体被发现，其得名亦来自于此【1】。随后的研究发现，XPR1具有降低细胞内磷酸水平的能力【2】，最终被确认为磷酸外排转运蛋白，并归类于溶质转运体超家族（SLC53A1）。对其细胞生物学与生物化学研究发现，XPR1的磷酸外排能力严重依赖肌醇多磷酸分子，磷酸肌醇化合物（如IP3和IP6）或焦磷酸肌醇化合物（如IP7和IP8）均能激活XPR1依赖的磷酸外流，其中焦磷酸肌醇的激活能力显著高于磷酸肌醇。XPR1及同源蛋白广泛存在于动物与植物之中，发挥着细胞内磷酸水平“定海神针”的作用。在植物中，XPR1的同源蛋白PHO1负责将磷从根部细胞质膜转运到木质部，从而帮助植物体高效分配关键营养元素磷【3】。在动物中，特别是在人体中，XPR1在耗能旺盛的组织中（如脑组织）快速外排ATP水解产生的游离磷酸，从而避免其在细胞中的堆积，防止造成pH的偏移以及与钙形成结晶沉淀。XPR1的功能失调可引起多种钙化疾病，例如原发性家族性脑钙化与血栓形成【4, 5】，并可通过影响破骨细胞功能而导致成骨发育不全。探索XPR1的分子特性与其介导的磷酸流特征，特别是焦磷酸肌醇调控XPR1活性的结构基础，对于理解细胞调节磷酸稳态的分子机制以及钙化疾病的分子病理至关重要。图1：XPR1的冷冻电镜结构。高亮发光的分子为焦磷酸肌醇。
（有趣的是，磷的拼音文字名称源自于希腊文Φωσφόρος，意为启明星与光亮；而磷的象形文字本字为粦，亦有火光之意）
经过结构与功能生物学家们多年的摸索，近期XPR1的研究突破层见叠出，呈现井喷态势。继上月Nature杂志发表姜道华团队对XPR1的结构解析工作之后（BioART链接：Nature | 姜道华团队揭示磷酸转运蛋白XPR1转运和调控的分子机制），上海交通大学医学院附属第九人民医院曹禹团队与中国药科大学于烨团队于2024年9月26日在Science杂志上以“First Release”的形式提前在线发表了题为Structural basis for inositol pyrophosphate gating of the phosphate channel XPR1（磷酸通道XPR1受肌醇焦磷酸门控的结构基础）的研究论文。该论文结合结构生物学与电生理方法针对人类XPR1的结构、功能与调控方式进行了全面解析，发现XPR1具备了多磷酸肌醇门控磷酸通道的基本结构与电生理特征，并阐明了多磷酸肌醇以“双重结合”的激活方式调控磷酸电流的分子机制。冷冻电镜分析显示，人类XPR1呈二聚体结构（图1），每个单体分子包含一个十α螺旋构成的跨膜结构域（TMD）和一个位于细胞内的可溶SPX结构域，后者得名于“SYG1 | Pho81 | XPR1”，三者均包含这一结构域。在空载状态下，XPR1呈现关闭状态，并且仅能观察到TMD结构域，其SPX结构域的对应密度仅能见其轮廓，无法获得解析。通过添加门控激动剂IP6，研究人员发现XPR1的构象进入变化状态，在电镜样品中可以同时观察到开放态、关闭态以及开放-关闭态异二聚体，显示出IP6激活XPR1的能力。在开放态的XPR1中，可以观察到一条贯穿膜内外的离子通道（图2&3），这对XPR1的传统认知角色提出了挑战，提示它虽然被归类为溶质转运体家族，但是可能执行离子通道的功能，而非通过传统的转运体模式进行磷酸运输。为验证这一猜测，研究团队利用电生理的方法对XPR1的功能进行了表征。全细胞膜片钳记录所显示的显著宏观电流，与单通道记录中磷酸根离子的快速通透及其开关转换现象，进一步确立了XPR1作为多磷酸肌醇门控磷酸通道的分子功能（图3）。尽管XPR1的多个构象得到解析，跨膜结构域与SPX之间的高度柔性的空间排布使其难以一窥全貌。为解决这一问题，研究人员采用添加磷酸转运抑制剂膦甲酸（PPF）以及磷酸根类似物的方法进一步稳定或者减缓XPR1在工作状态下的构象变换，最终联合使用PPF和IP6获得了处于对称与关闭状态下的XPR1整体结构（图1）。与姜道华团队联合磷酸和IP6所获得的结构类似【6】，这一结构整体呈C2对称，SPX与跨膜结构域共享对称轴，并且在SPX二聚化界面发现了IP6的电子密度，显示SPX本身互不接触，而是通过IP6介导进行二聚化。PPF的电子密度则位于通道之内，对应于在XPR1-磷酸复合物中鉴定出的第二位点，发挥着阻碍通道的作用。图2：处于不同构象中的XPR1跨膜区离子通路状态。此前的功能研究提示，焦磷酸肌醇具有远比磷酸肌醇更为强大的XPR1激活能力【7】，本文的电生理的结果也证实，XPR1对IP7的亲和力约为IP6的二十倍左右。然而，对IP6结合位点的结构分析无法为这一激活能力差异提供答案。为探索焦磷酸肌醇强激活能力的分子机制，研究人员利用酶法催化结合化学分离方法，制备了较高纯度的IP7化合物，并以此获得了XPR1-IP7的复合物电镜结构。透过这一结构，研究人员意外地发现XPR1中存在着另一个多磷酸肌醇结合位点。与SPX二聚体间的已知结合位点（称之为interSPX位点）不同，第二个多磷酸肌醇结合位点位于每个XPR1单体内跨膜结构域与SPX结构域之间的部位（称为TMD-SPX位点）。该结合位点由分别从TMD和SPX结构域伸出的碱性氨基酸残基侧链组成，表面电荷性质与interSPX位点相似。所不同的是，TMD-SPX位点是一个远较interSPX位点更为“空旷”的结合口袋，碱性氨基酸残基侧链的空间距离较大，非常不利于尺寸较小的磷酸肌醇分子结合。与IP6分子相比，IP7上的焦磷酸基团显著提高了该方向上的负电荷表面尺寸，使之能够紧密结合于TMD-SPX位点之中并稳定了整体C2对称构象，从而激活XPR1。图3：XPR1的离子通道分析（上）与单通道电流（下）。为进一步还原XPR1在关闭-开放构象转换中的动态过程，研究人员还使用通透能力较差的磷酸根类似物来“减慢”构象转换速度，最终通过钨酸根的加入，获得了关闭-开放构象转换中的中间态结构。与开放构象比，中间构象保留了清晰可见的SPX结构域密度；与使用IP6/PPF所捕获的关闭构象相比，中间构象的整体C2对称轴受到了破坏，SPX二聚体向TMD二聚体的一侧倾斜，同时SPX二聚体之间发生滑动错位，展现了XPR1在转换过程中较为不稳定的中间过渡态结构。基于以上发现，该研究论文提出XPR1作为多磷酸肌醇门控的磷酸通道发挥磷酸外排的功能，磷酸肌醇与焦磷酸肌醇通过结合SPX结构域稳定构象使通道趋于开放。更重要的是，该论文发现了XPR1通道以一种“双重结合”的方式受到多磷酸肌醇的激活，其中新鉴定出的第二结合位点对焦磷酸肌醇具有较高的选择性。与磷酸肌醇相比，焦磷酸肌醇的出现是细胞内磷酸水平升高的标志。对焦磷酸肌醇的更高敏感性使得XPR1得以更精准地启动外排磷酸电流，从而实现磷酸稳态的平衡调节。这一研究成果加深了人们对细胞能量代谢与磷酸稳态调节的认识，并为脑钙化等磷酸稳态异常疾病的分子病理探索与干预手段开发提供了指导与借鉴。本论文由上海交通大学医学院附属第九人民医院精准医学研究院与骨科曹禹研究员与中国药科大学的于烨教授所率团队联合完成，第一作者为上海第九人民医院博士生鲁毅、中国药科大学博士生岳晨茜、美国西南医学中心的张丽博士和上海仁济医院的姚德强副研究员。本项研究的完成得益于第九人民医院骨科赵杰教授与秦安研究员以及复旦大学周璐教授的合作与支持。磷是生命的关键元素之一，在人体中的含量仅次于氧、碳、氢、氮。磷酸根作为细胞内丰度最高的无机阴离子之一，参与了从能量代谢到信号转导的多种生命过程。为维持生命活动的有序进行，细胞内的磷酸水平必须受到严格调控。细胞膜上存在多种转运蛋白来平衡磷酸的输入输出，其中负责磷酸摄取的蛋白包括SLC20和SLC34家族的多个成员。然而，令人惊讶的是，人体中已知负责磷酸外排的蛋白仅有SLC53A1（又名XPR1）一种。XPR1作为唯一的磷酸外排蛋白，其重要性不言而喻。先前的研究表明，XPR1具有结合多磷酸肌醇并向细胞外排放磷酸的能力，但其具体工作机制一直不明。近期，上海交通大学医学院曹禹团队与中国药科大学于烨团队合作，在《Science》杂志上发表了一项突破性研究，从结构到功能对XPR1进行了全面表征，揭示了其作为多磷酸肌醇门控磷酸通道的本质。研究团队通过冷冻电镜技术解析了XPR1在多种状态下的结构，包括空载态、磷酸肌醇结合态、焦磷酸肌醇结合态等。结构分析显示，XPR1呈二聚体结构，每个单体包含一个跨膜结构域（TMD）和一个细胞内的可溶SPX结构域。令人惊讶的是，XPR1的开放构象中存在一条贯穿膜内外的离子通道，这一发现挑战了XPR1作为传统溶质转运体的认知。为验证XPR1的通道特性，研究团队进行了详细的电生理实验。全细胞膜片钳记录显示了显著的宏观电流，而单通道记录则呈现出磷酸根离子的快速通透和开关转换现象。这些电生理特征进一步确立了XPR1作为磷酸通道而非传统转运体的功能定位。研究的另一重大发现是XPR1受到多磷酸肌醇的"双重结合"调控机制。除了已知的位于SPX结构域的经典结合位点（interSPX位点）外，研究人员还发现了一个新的结合位点（TMD-SPX位点）。这个新位点位于SPX与跨膜区之间，对焦磷酸肌醇（如IP7）表现出更高的选择性。焦磷酸肌醇作为细胞内磷酸水平升高的标志，能够更有效地激活XPR1，从而实现对磷酸外排的精确调控。这项研究不仅拓展了人们对阴离子通道的认知，也为理解细胞如何精确调控磷酸稳态提供了新的见解。XPR1作为一个多磷酸肌醇门控的磷酸通道蛋白，能够快速响应细胞内磷酸过载信号（焦磷酸肌醇的增加），开放通道介导外向磷酸电流，从而实现细胞内磷酸稳态的快速再平衡。此外，研究团队在方法学上也有创新。他们成功地在同一样品中分析了代表不同构象的颗粒群体，并通过使用非天然底物离子钨酸来降低构象转换速度，捕获了XPR1的中间态结构。这一策略展示了冷冻电镜技术在处理混杂样品和非热力学稳定状态构象方面的强大能力。总的来说，这项研究不仅揭示了XPR1的工作机制，也为理解和治疗与磷酸代谢相关的疾病（如原发性家族性脑钙化和血栓形成）提供了新的思路。同时，它也为未来设计靶向XPR1的药物，以调节细胞内磷酸水平，开辟了新的可能性。磷是生命活动中不可或缺的关键常量营养素，其稳态的失衡与多种神经系统疾病密切相关。XPR1是迄今发现的哺乳动物中唯一负责磷酸盐外排的转运体，对其结构与功能的研究对于揭示神经系统中磷酸根跨膜转运的分子机制具有重要意义。已有研究表明，磷转运蛋白如XPR1和PiT2在星形胶质细胞中高表达，并调节脑内无机磷酸根（Pi）的稳态。XPR1功能的缺失可能引发钙磷代谢失衡，从而导致脑钙化症的发生。尽管目前已经确立了磷转运蛋白与脑钙化症之间的关联，但其分子机制，尤其是XPR1的SPX结构域如何调控磷酸根外排的机制，仍需深入研究。XPR1的结构和功能研究经过多年的积累，近期迎来了重要突破，研究成果呈现出井喷式发展。继上月Nature杂志发表姜道华团队对XPR1的结构解析成果之后，2024年9月26日，上海交通大学医学院第九人民医院曹禹团队与中国药科大学于烨团队在Science杂志上以“First Release”形式提前在线发表了题为Structural basis for inositol pyrophosphate gating of the phosphate channel XPR1的研究论文。该研究结合了结构生物学与电生理学方法，全面解析了人类XPR1的结构、功能和调控机制，揭示了XPR1作为焦磷酸肌醇门控磷酸根离子通道的基本结构与功能特征，深入阐释了焦磷酸肌醇通过“双重结合”激活XPR1并调控磷酸盐电流的分子机制。这一发现为理解磷酸盐跨膜转运及其调控机制提供了重要依据，并为相关疾病的诊断和治疗开辟了新的研究方向。尽管XPR1的多个构象已经被解析，跨膜结构域与SPX结构域之间高度柔性的空间排布仍然限制了我们对其整体动态的深入理解。为了解决这一问题，曹禹团队通过添加磷酸转运抑制剂膦甲酸（PPF）和磷酸根类似物，进一步稳定或减缓XPR1在不同工作状态下的构象变化。最终，联合使用PPF和IP6，成功获得了对称的处于关闭和激活状态的XPR1完整结构。为了揭示XPR1在从关闭到开放构象转换过程中的动态变化，研究团队使用通透性较低的磷酸根类似物来“减慢”这一转换过程，捕捉到了该过程中重要的中间态结构。于烨团队在此基础上，结合磷酸根外排过程中观察到的多种构象，创新性地调整了传统磷酸转运蛋白的研究模式。他们通过全细胞膜片钳和单通道记录技术，克服了胞内部分阳离子形式对磷酸根流动的干扰，最终证实XPR1具有典型的离子通道特征。此外，利用inside-out macro-patch模式下的快速细胞内液切换技术，团队进一步精确评估了焦磷酸肌醇和肌醇磷酸激活XPR1的关键残基，并分析了其选择性通透无机磷酸根的能力。这项研究有助于在原子水平理解磷酸盐在细胞信号转导和能量代谢中的重要性。在神经系统中，磷酸盐不仅是ATP合成的核心元素，还参与核酸、磷脂及多种信号分子的合成与调控。神经系统的能量代谢、神经递质的合成及突触功能高度依赖磷酸盐的充足供应。XPR1作为磷酸盐转运体，其结构解析为理解神经系统中磷酸盐的高效跨膜转运提供了新的见解。此外，该研究为探讨XPR1在神经系统疾病中的致病机制奠定了基础。例如，XPR1的特定位点变异（如R459C和R570C）已被证明与原发性家族性脑钙化症（PFBC）相关。通过进一步的结构解析，可以将这些变异与功能缺陷联系起来，为理解PFBC的病理机制提供新线索。同时，磷酸盐代谢的紊乱还可能与阿尔茨海默病、帕金森病及肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病相关。XPR1结构功能的进一步研究将有助于阐明磷酸盐代谢障碍如何影响神经系统的功能。该研究还发现，XPR1具有一个特异性结合焦磷酸肌醇5-IP7的位点，显示出对焦磷酸肌醇和肌醇磷酸的选择性偏好。虽然两者均能反映细胞内磷酸盐过载，但磷酸肌醇更常作为第二信使参与细胞信号传导，而焦磷酸肌醇则感应细胞内的能量状态。XPR1对这些分子的偏好性调控是否与特定细胞条件或信号分子有互作关系，是否通过复杂的信号网络使XPR1能够在不同生理条件下灵活调节磷代谢，尚需进一步研究。伴随着XPR1在磷酸盐外排机制与其功能调控上的一系列重大进展，靶向XPR1的药物开发正在迎来新的契机。通过调控XPR1的活化，不仅为治疗脑钙化症提供了创新性的治疗策略，还可能在神经退行性疾病的治疗上开辟出新的方向。未来，基于XPR1的药物开发有望成为磷酸盐稳态失衡相关疾病治疗的关键突破点。在从无序向有序生命系统的演化过程中，利用磷酸完成重要生命活动是最具令人瞩目的创举之一。一方面，磷酸酯为编码遗传信息的生物大分子（如RNA和后来的DNA）提供了极其稳定的骨架；另一方面，生命利用磷酸激酶和磷酸酶，实现了对蛋白功能和信号转导的时序性与空间上的精确开关调节。此外，磷酸酐键，尤其是三磷酸腺苷（ATP），通过储存、传递和产生能量，驱动了生命活动的正常运转。因此细胞时时刻刻面临着无机磷酸（Pi）需求和供给的重大波动。在细胞周期的S期，DNA会进行复制，需要大量的磷酸；同时，旺盛的蛋白的合成，会消耗大量ATP，产生过量的磷酸。因此细胞既要满足源源不断的磷酸需求，更要防止细胞质中磷酸的过量积累。因为大量无机磷酸的积累会改变细胞内环境的pH，影响重要生化反应的平衡并，最终阻碍细胞的正常代谢。磷酸的缺乏可能只会延缓细胞的生长和分裂，但是细胞质中磷酸浓度过高，细胞内磷酸稳态失调，会导致更严重的后果。例如，在真核生物中，细胞内磷酸的积累会导致酵母细胞磷酸中毒，植物生长严重迟缓和矮化，人类神经退行性疾病的发生或肾性Fanconi综合征等危害。因此，细胞内磷酸稳态不仅是细胞生物学的一个基础课题，也日益成为医学和农业领域的研究热点。细胞内积累的磷酸的排放依赖于肌醇多磷酸分子。磷酸肌醇是一类重要的信号分子家族，其特征是单磷酸排列在肌醇核心骨架周围，从单磷酸化（InsP）到全磷酸化的InsP6（inositol hexakisphosphate，IP6），这些分子是由InsP激酶通过可逆地向肌醇六元环骨架特定位置添加磷酸基团而生成的。在IP6的基础上，磷酸肌醇还可以被肌醇焦磷酸激酶（PPIP5K）进一步磷酸化，产生高能的焦磷酸肌醇类化合物PP-InsPs，主要包括5PP-InsP5（IP7）和1,5(PP)2-InsP4（IP8）。尽管IP7和IP8在细胞中的浓度较低，但它们的功能非常特殊且重要。它们具有高能磷酸键，能够参与调控多种细胞过程，包括代谢、发育和信号传导。更重要的是，焦磷酸肌醇与多种能量代谢状态相关联，被称为“代谢信使”分子，其细胞内水平的提高通常是无机磷酸浓度积累的标志。为响应细胞内磷酸水平并做出调整，生物体进化出一类被称为SPX结构域的蛋白质结构模块，用于感知磷酸肌醇尤其是焦磷酸肌醇的浓度变化。在酵母与植物中，均存在多种包含SPX结构域的蛋白，如酵母磷酸转运蛋白Syg1、酵母多磷酸合成酶亚基Vtc2/3/4、植物磷酸转运蛋白PHO1等，它们复杂协助酵母和植物响应机体磷酸需求，从环境摄取磷酸并在植物体各个部分之间进行转运。动物由于磷酸来源多样性，仅仅保留了一种包含SPX结构域的蛋白，即XPR1。作为在进化过程中硕果仅存的动物SPX蛋白，XPR1通过响应PP-InsPs而在人细胞中发挥磷酸盐外排功能维持磷酸稳态。为理解XPR1感知焦磷酸肌醇并执行磷酸外排功能的分子机制，上海交通大学曹禹课题组与中国药科大学于烨课题组通过结构生物学与功能生物学的多领域交叉合作，完成了人类XPR1结合焦磷酸肌醇状态下的结构解析，并系统研究了该蛋白介导的磷酸电流特征。这一研究成果率先揭示了XPR1以不同的方式识别磷酸肌醇与焦磷酸肌醇：一个低选择性位点可以同时捕获磷酸肌醇与焦磷酸肌醇；而另一个高选择性位点专门用于识别焦磷酸肌醇。这一双重结合的方式，反映了XPR1催化的磷酸外排活动受到非常复杂的调制，面对不同磷酸代谢状态下磷酸肌醇和焦磷酸肌醇的水平差异，XPR1可以进行精细的“加速”与“减速”，实现对细胞内磷酸稳态的严格控制。此外，对XPR1的电生理研究以提出了一个全新的理论：XPR1可能并非此前所认定的磷酸转运体蛋白，而是以磷酸通道的身份来实现更为迅速的磷酸排放，这些全新的发现，为我们理解人类细胞响应代谢状态来管控自身磷酸稳态的分子过程提供了直观可靠的结构基础。http://doi.org/10.1126/science.adp3252制版人：十一
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