前两日双星陨落，我国一天痛失两位院士。一位是让中国人吃饱的“杂交水稻之父”袁隆平，一位是“中国肝胆外科之父”吴孟超。吴老曾以1960年至1977年间切除治疗原发性肝癌181例、总手术成功率91.2%的经历，震惊国际医学界。我们谨以此篇来表达对吴老诚挚的感谢和由衷的默哀。
图片来源：央视新闻
今天我们的肿瘤微环境和免疫专题，要给大家分享的第一篇文章是发表在Cell上的基于单细胞转录组对早期复发肝细胞癌进行肿瘤微环境异质性研究的深度好文。今天我们不学套路，只学这篇文章的扎实分析方法，清晰结构逻辑，以及如何从最基础的生信分析结果中挖掘出对临床治疗具有重要指导意义的结论！文章标题：Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma.
肝细胞癌(HCC)复发率高，5年生存率低。术后2年内的早期复发占比高（70%），与术后快速复发相关的分子机制仍然知之甚少。近年来，免疫检查点阻断(ICBS)在几种癌症中显示出临床效益。免疫微环境可能影响ICBS的治疗效果，解剖肝癌的肿瘤生态系统，特别是复发肿瘤患者的肿瘤微环境和免疫表型，可以加深对免疫逃逸机制的了解。利用早期复发性肝癌的单细胞图谱，在单细胞分辨率水平上研究肿瘤微环境中细胞成分及其相互作用，了解与肿瘤发展相关的机制，有助于发现更有效的肝癌免疫治疗策略。
1、原发和早期复发肝癌的细胞群鉴定
基于12例原发性肝细胞癌患者的肿瘤组织（ PT ）和配对的相邻非肿瘤组织（PNT），以及6例早期复发肝细胞癌患者的肿瘤组织（RT）和配对相邻的非肿瘤组织（RNT）的单细胞测序数据，使用Seurat进行细胞分类和标记基因鉴定，T-SNE识别和可视化得到24个簇。细胞群鉴定到的非免疫细胞主要有内皮细胞(PECAM1、CDH5)；肝星状细胞(ACTA2、PDGFRB)；正常上皮细胞（EPCAM和KRT19）和肝细胞癌恶性细胞（用肝脏、增殖、免疫监视或免疫逃逸相关基因的mean log2(TPM+1)表达标准化来确定恶性细胞特征）。在肿瘤患者中大多数非免疫细胞是恶性细胞，而内皮细胞和肝星状细胞占比较低。已鉴定的免疫细胞包括髓系细胞(LYZ、C1QB)；T细胞(CD3D/G)、B细胞(MS4A1、CD79A)、浆细胞(IGLL1、MZB1)和NK细胞(KLRF1、KLRD1)。所有患者的B细胞、浆细胞样树突状细胞和浆细胞的浸润水平相对较低。不同患者的免疫细胞群占比不同，显示了肝癌肿瘤间免疫细胞组成的显著异质性。（小编有话说：文章中的免疫细胞及非免疫细胞的marker基因可以收录起来了）。
2、原发和早期复发肝癌的细胞亚群鉴定
接下来，作者对髓系细胞和T细胞/NK细胞进行了无监督的聚类。在髓系细胞中分为11个簇，包括5个巨噬细胞簇(Macro1-Macro5)，2个单核细胞簇(Mono1和Mono2)，3个树突状细胞簇(DC1-DC3)，1个循环细胞簇(Cycling)。T细胞/NK的重新聚类显示了17个簇，包括2个NK亚型(NK CD16和CD160)，4个CD4+T细胞亚型(CD4 CCR7、CD4 IL2、Treg FOXP3和Treg LAYN)，以及7个CD8+T细胞亚型(CD8 CCR6、CD8 NR4A1、CD8 GZMK、CD8 XCL1、CD8 CTLA4和CD8 LAG3)。NK CD160细胞在邻近非肿瘤组织(PNT和RNT)中富集，CD69、NR4A1、CD160和CXCR6高表达，FCGR3A低表达，说明它们代表组织驻留的记忆性NK细胞。而FCGR3A在NK CD16细胞中高表达，表明NK CD16细胞可能是从外周血招募的。NK CD16细胞是肿瘤中发现的主要NK细胞，说明外周血NK细胞是肿瘤浸润性NK细胞的主要来源。
由于细胞周期相关基因(HMGN2、RRM2和MKI67)的过度表达，一群T细胞被指定为周期细胞，这些细胞由Tregs和CD8+T细胞组成。在复发性肝癌样本（RT）中观察到的周期细胞比例比原发性肝癌样本（PT）少，反映了RT相对静止的免疫反应。在肿瘤组织样本中，RT样本中CD8+T细胞亚群的总比例比PT中更高。而CD4+T细胞的比例显示出相反的趋势。综上所述，与原发性肝癌微环境相比，复发性肝癌呈现独特的免疫生态系统，即DC比例增加，Tregs减少，T细胞增殖减少，CD8+T细胞丰度更高。最后，作者还通过验证集1的4对匹配的PT和RT样本scRNA-seq数据以及在来自验证集2的47对PT和RT样本中IHC来验证了这些结果。
（小编有话说：以上分析结果都是对单细胞测序数据进行细胞群鉴定以及细胞亚型细分，通过鉴定到的细胞类型的基因表达特征及细胞占比差异，筛选出与复发肿瘤最相关的细胞类型进行深入挖掘。在本文中，与原发性肝癌相比，复发性肝癌中CD8+T细胞丰度更高，因此作者选择了CD8+T细胞进行进一步分析。）
3、CD8+T细胞在原发性肝癌和早期复发肝癌中的分化轨迹
作者通过Monocle推断细胞分化轨迹来探索肝细胞癌浸润的CD8+T细胞中的免疫状态和细胞分化。伪时序分析表明，CD8 CCR6细胞处于分化轨迹的开始，而CD8 CLTA4细胞和大多数CD8 XCL1细胞处于终末状态。基于对不同细胞类型间的TCR克隆扩增分析，作者发现，与具有细胞毒性的CD8 GZMH和CD8 GZMK细胞相比，CD8 CLTA4细胞与CD8 XCL1细胞共享更多的TCR克隆。通过整合TCR克隆和轨迹信息，作者确定CD8+T细胞分化始于CD8CCR6和CD8NR4A1细胞，通过以CD8GZMH和CD8GZMK细胞为特征的中间细胞毒性状态，最终达到以CD8CLTA4和CD8XCL1细胞为特征的耗竭状态。
接下来，为了探究早期复发肝癌（RT）中的CD8+T细胞是否具有独特的分化轨迹，作者分别对原发性肝癌（PT）和早期复发肝癌（RT）样本中CD8+T细胞的分化进行了更深入的挖掘。值得注意的是，早期CD8+T细胞主要分布在RT样本中，分化末端的细胞较少，而PT样本中的CD8+T细胞主要分布在细胞毒性和耗竭状态的末端。作者研究了与过渡状态相关的转录变化，观察到CD8+T细胞簇可以分为4个阶段。CD8 CCR6和CD8 NR4A1细胞主要为第1阶段细胞，CCR6、CCR7、NCR3和KLRB1表达上调，GZMA、GZMB和GZMH表达降低，提示这些细胞具有最低的细胞毒能力。第2阶段细胞显示Jun、FOS、NR4A1和NR4A3的表达水平最高，与肝脏驻留记忆细胞的表型一致。第3阶段细胞的特征是经典细胞毒性基因(GZMH、GZMB、GZMA和GNLY)表达水平升高，T细胞耗竭标志物(PDCD1、CTLA4和HAVCR2)表达降低。途径分析表明，处于第3阶段的细胞依赖脂肪酸代谢，与效应T细胞表型一致。第4阶段细胞的特征是高水平的T细胞耗竭相关因子，包括Eome、TOX、TOX 2、HOPX Arnt、ETV 1和IRF8，以及参与PD-1和有丝分裂途径的基因，进一步证实了这些细胞的耗竭状态。
值得注意的是，免疫检查点分子PDCD1和LAYN在细胞毒性状态(第3阶段)和耗竭状态(第4阶段)之间的转换过程中只有轻微上调，而CTLA4和HAVCR2的表达增加了10倍。BTLA的表达仅在PT中观察到，而LAG3和TIGIT的表达从失活状态到耗竭状态逐渐增加。这些结果表明，在CD8+T细胞状态转换过程中，免疫检查点的表达是异质性的。特异性靶向治疗策略可能有利于ICB治疗方案在肝癌患者中的应用。RT样本中的CD8+T细胞主要表现为1期和2期，表现为常驻记忆表型。相反，PT中的CD8+T细胞主要表现为3期和4期，代表了从细胞毒性状态到耗竭状态的转变过程。尽管RT和PT样本显示了类似比例的3期细胞，但它们属于不同的细胞毒性细胞群，RT样本与CD8 GZMH细胞相关，PT样本与CD8 GZMK细胞相关。总之：PT和RT样本中CD8+T细胞表现出相同的分化轨迹，但表现出明显不同的免疫和转录状态，提示对于原发性和复发性肝癌患者的治疗应考虑不同的免疫治疗策略。（小编有话说：主题升华了！怎么就从细胞轨迹分析上升到了靶向治疗策略！这段对于伪时序分析的结果描述可以当范文拿小本本记下来了！如何将生信分析结果与临床治疗联系起来，你get到了吗？）
4、早期复发性肝癌中CD8+T细胞转录特征分析
为了进一步研究早期复发性肝癌样本中CD8+T细胞的独特转录状态，作者首先通过测定了组织驻留、细胞毒性、共刺激和耗竭T细胞表型的表达分数。与原发性肝癌样本（PT）相比，早期复发性肝癌样本（RT）中的CD8+T细胞耗竭信号的表达减少，表达免疫检查点基因的细胞比例减少，组织驻留基因增加，而共刺激和耗竭分子减少。IPA途径分析显示，RT中CD8+T细胞的特征是OX40下调和耗竭的T细胞信号通路，表明这些细胞处于较低的激活状态，但并未耗尽。IPA还发现PDGF-BB是介导这一表型的最高上游因子。由于PDGF-BB可以抑制T细胞增殖，作者推测这可能是复发性肝癌中CD8+T细胞处于非激活状态的主要驱动因素。与PT样本中的细胞相比，RT样本中的CD8+T细胞对氧化应激的反应增强。此外，这些细胞还强烈下调氧化磷酸化途径中的基因，提示可能存在线粒体功能障碍。代谢紊乱也可能是RT中CD8+T细胞功能障碍的原因之一。然后通过基因差异表达（DEG）分析，发现RT中的CD8+T细胞上调KLRB1和IL7R，显示出记忆性T细胞表型。KLRG1、NCR3和RORA的表达增加也表明存在2型固有淋巴样细胞(ILC2)表型。
接下来，作者通过在验证集2中进行双色IHC染色，进一步验证了RT样本中CD8+CD161+T细胞的富集。为了评估这些细胞的效应功能，作者分离了肿瘤浸润的CD8+CD161+和CD8+CD161-T细胞，并用流式细胞仪检测GZMB的表达水平。CD8+CD161+T细胞的GZMB丰度低于CD8+CD161-T细胞，表明具有较弱的细胞毒性作用。。此外，KLRB1 high CD8+T细胞和KLRB1 low CD8+T细胞之间的转录谱比较发现IL23A的表达显著增加，几种T细胞趋化因子(CCL4、CCL5和CXCL13)的表达降低，这可能会抑制传统效应CD8+T细胞和NK细胞对复发肿瘤的浸润。最后，作者将与KLRB1 High CD8+T细胞相关的前50个上调基因作为基因表达特征，根据bulk RNA-seq将验证2中39名早期复发患者分成高分组和低分组。高分组与明显较差的临床预后相关。再通过TCGA数据库中原发性HCC数据分析也证实了KLRB1 high CD8+ T细胞相关的基因表达特征是肝癌患者不良预后的重要指标。综上所述，与原发性肝癌样本中观察到的耗竭状态不同，早期复发肝癌样本中CD8+T细胞以KLRB1过度表达为特征，表现为一种先天的功能紊乱状态，细胞毒性和免疫抑制表型较低。值得注意的是，与KLRB1 High CD8T细胞相关的基因表达特征的丰富与复发和原发性肝癌的不良预后和肿瘤进展相关。
5、CD8+T细胞在早期复发肝癌中克隆性增殖降低
接下来，作者检测了CD8+T细胞的克隆扩增能力。在同一患者中，与一个以上T细胞共享相同TCR克隆的T细胞被定义为克隆性T细胞。结果发现克隆CD8+T细胞的比例在早期复发性肝癌组织（RT）和正常组织样本（RNT）之间没有差异，表明这些T细胞克隆没有表现出从PT到RT的明显增殖。而原发性肝癌样本（PT）明显高于正常组织样本（PNT），这表明在RT中，邻近的非肿瘤组织可以为肿瘤部位的浸润提供更多的CD8+T细胞。TCR分析显示RT组CD8+T细胞克隆性增殖有限，且与PT组CD8+T细胞的TCR克隆类型基本相同。这一发现表明，RT中的CD161+CD8+T细胞可以启动有效的免疫应答，靶向原发肿瘤中的克隆性肿瘤抗原，但在RT中不能有效地激活。进一步分析成对的原发和复发肿瘤细胞的测序数据显示，早期复发肿瘤细胞的起源是亚克隆。因此，次要的亚克隆而不是主要的克隆，促进了早期复发，并成为复发肿瘤的主要克隆。
6、恶性肿瘤细胞在早期复发肝癌肿瘤微环境中的作用
前面的分析结果表明复发性肝癌Tregs比例降低，巨噬细胞或其他免疫抑制T细胞亚型没有增加。据此作者推测，原发性肝癌（PT）和复发性肝癌（RT）在肿瘤生态系统中的实质性差异可能是由恶性肿瘤细胞的差异引起的。为了研究这些差异，作者对PT和RT恶性细胞进行了DEG分析。结果发现PT中参与细胞周期相关通路的基因丰富，而RT中上调的基因主要属于免疫反应通路。还观察到PT样本有更高的增殖信号和更低的肝功能信号，而RT样本表现出更高的免疫监视和逃逸信号。在RT恶性肿瘤细胞中CD47的表达增加，表明DC成熟和抗原提呈受到潜在的抑制，以及对巨噬细胞靶向的抵抗。同样，在RT中观察到HLA/B/C的表达水平增加，表明对NK介导的细胞死亡的抵抗力增强。综上所述，RT具有低的增殖率和高的逃避免疫介导的细胞死亡的能力。
ICB疗法在不同癌症类型和不同患者之间有着不同的疗效，因此在更好地了解原发性和复发性肝癌微环境中免疫检查点表达的异质性的基础上，确定哪些患者可能从ICB中受益，并建立最佳的免疫治疗策略具有重要的临床意义。因此作者检测了免疫检查点配体和受体的表达，结果显示PDCD1(PD-1)在一小部分T细胞中表达，而HAVCR2和CTLA4的表达较高，提示TIM-3或CTLA-4阻断可能对肝癌的治疗有更显著的益处。这些发现至少在一定程度上可以解释，与仅使用PD-1抑制剂的临床试验相比，在联合使用PD-1和CTLA-4抑制剂的临床试验中观察到更好的免疫应答。更重要的是，作者发现免疫检查点基因CTLA4、HAVCR2和TIGIT在复发肿瘤的T细胞中表达降低，这表明针对这些标志物的检查点阻断方法可能对原发性肝癌有效，但对复发患者无效。值得注意的是，复发性肿瘤细胞表现出CD47的表达增加，已有研究表明CD47阻断可抑制肝癌小鼠模型中的肿瘤生长。这些结果表明，治疗原发性或复发性肝癌需要不同的治疗方法，基于CD47的抗肿瘤治疗可能是肝癌早期复发的一种可行的预防选择，而多种ICB的联合可能对晚期肝癌人群有利。（小编有话说：从单细胞测序的生信分析结果得出用于原发性肝癌及复发性肝癌的免疫治疗指导方案，文章的点睛之笔了！）
（1）早期复发性肝癌有一个独特的免疫生态系统，其特征是经典免疫抑制细胞Tregs的比例减少，树突状细胞和先天性CD161+CD8+T细胞比例增加；
（2）复发肿瘤中CD8+T细胞高表达KLRB1(CD161)，并表现出天然的低细胞毒状态，克隆性低，与原发性肝癌的经典耗竭状态不同。这些细胞的富集与较差的预后有关。
（3）差异基因表达和相互作用分析揭示了复发肿瘤细胞中潜在的免疫逃避机制，这些机制抑制了树突状细胞抗原提呈，并招募了先天性CD8+T细胞。复发的恶性细胞与树突状细胞和T细胞之间存在活跃的串扰，这可能会促进肿瘤细胞免疫逃逸。
（4）scRNA-seq结合TCR-seq分析表明，早期复发肿瘤细胞的起源是亚克隆，而不是主要的克隆。复发过程中主要克隆性肿瘤抗原的丢失可能解释了为什么具有记忆性表型的CD161+CD8+T细胞不能防止复发，因为CD161+CD8+T细胞在RT中不能识别次要的亚克隆性肿瘤抗原。
总之，这项研究在免疫和肿瘤表型、T细胞发育轨迹、TCR克隆性和独特转录特征方面提供了原发性和早期复发肝癌之间肿瘤生态系统异质性的证据。该研究数据可能是一个有价值的资源，有助于更深入地了解与早期复发相关的机制，并帮助开发更有效的治疗靶点和免疫治疗的生物标记物。
