PacBio测序实现复杂细菌基因组的完整组装

Pacific Biosciences第三代测序仪的出现，明显改进了基因组测序的读长，促进了完整基因组的组装。不过，目前还没有研究单独使用PacBio的数据来完整测序双染色体的细菌基因组，早期版本的测序试剂最多能够完成单染色体的细菌基因组测序。

在这项研究中，香港大学的研究团队将PacBio RS II测序系统与Illumina HiSeq 1500测序仪的性能进行了比较。他们对类鼻疽杆菌（Burkholderia pseudomallei）的基因组进行测序。这种细菌有两个大的环状染色体，GC含量高达68-69%，富含高度重复的区域。

测序结束后，研究人员尝试了混合和单独的组装。他们指出，单独使用Illumina数据产生了有200多个contig的基因组草图，表明这个平台对PCR扩增的依赖对于富含GC的基因组来说是有问题的。三种不同的短读长组装工具也无法改善结果。他们报告称，两种测序数据的混合组装也不大成功，产生了74个contig。

然而，单独使用PacBio的数据进行组装，却带来了迥然不同的结果。这种方法实现了双染色体的类鼻疽杆菌基因组的完整组装，而无需进一步的测序。研究人员认为，这证明了PacBio SMRT技术在细菌基因组测序中的作用，特别是那些众所周知的难测序基因组。

他们将组装的染色体contig与参考基因组比对，发现准确性高于99.9%。重要的是，此次组装还能准确鉴定出蛋白质编码区（CDS）的数量及其分布、四个核糖体操纵子、核心蛋白和毒力蛋白，以及MLST基因座。

相比之下，Illumina测序不能够分辨这些重复区域，因为它们的序列长度不够，无法跨越那些不同种类的重复区域。

研究人员也对项目成本进行了评估。他们表示，在使用Sanger测序或二代测序平台来完成细菌基因组的测序时，主要的成本和时间都是花在填补缺口的阶段。据估计，在使用二代测序平台时，大约95%的经费和时间都是用来完成细菌基因组的最后1%。

他们认为，PacBio的SMRT测序则不同。“尽管每个碱基的成本更高，但在de novo组装之后就不需要额外的手动工作，且重复区域和移动元件的完整组装也值回票价，”研究人员谈道。