金振口服液氨基酸特征指纹图谱及29种氨基酸同时定量的质量控制方法研究

金振口服液（ Jinzhen Oral Liquid ， JOL ）为江苏康缘药业股份有限公司独家产品，收载于《中国药典》 2015 年版一部，由山羊角、黄芩、平贝母、甘草、大黄、石膏、人工牛黄及青礞石 8 味中药配伍而成，具有清热解毒、祛痰止咳之功 ^[1] 。临床上主要用于治疗小儿急性支气管炎 ^[2-5] 、手足口病 ^[6-8] 、肺炎 ^[9] 和流感 ^[10-11] 等。其疗效确切、安全性好、依从性高，是我国儿童医疗保险品种，被誉为治疗小儿肺热咳嗽的妙药。

目前 JOL 的质量标准偏低：现行《中国药典》 2015 年版采用 HPLC 对单一指标黄芩苷进行含量测定（不少于 0.25 mg/mL ）来控制制剂质量 ^[1] 。刘晓秋等 ^[12] 对药典方法进行优化，除黄芩苷以外，增加了另一个指标成分甘草酸的含量测定。含量测定方面，曹云飞等 ^[13] 利用 HPLC 测定 JOL 中大黄素和大黄酚的含量。杨智慧等 ^[14] 利用 HPLC 对 JOL 中的黄芩苷、甘草酸、大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素 6 个成分进行含量测定。指纹图谱方面，胡军华等 ^[15] 建立了 JOL 的 HPLC-UV 指纹图谱，标定 17 个共有峰，但是仅明确指认了 1 个色谱峰。

基于以上文献调研，课题组前期建立了 JOL 的高效液相色谱 - 紫外真空波 - 蒸发光散射检测器（ HPLC-UVD-ELSD ）特征指纹图谱，结合 13 个主要代表性成分同时定量的方法，对市售制剂进行整体质量控制 ^[16] ，但是尚未能反映君药山羊角对制剂的成分贡献。因此，为表征源于山羊角的氨基酸类成分，本研究采用氨基酸自动分析仪建立 JOL 氨基酸特征指纹图谱，对 29 个主要特征峰进行明确化学指认，运用中药指纹图谱相似度软件对 16 批市售制剂进行相似度评价，同时对 29 种氨基酸进行含量测定。多批次市售制剂质量评价结果显示， JOL 中氨基酸总含量平均值为 1 014.375 μg/mL ，约占固含物的 0.65% 。氨基酸类成分定性定量研究在一定程度上明确了动物药材山羊角对制剂组方的成分贡献，为构建 JOL 全方位质量评价体系提供了有益补充。

1 仪器与材料

L-8900 氨基酸自动分析仪，日立 Hitachi 公司； SI-234 电子天平，美国 Denver 公司； P300H 超声波清洗器，德国 Elma 公司； Milli-Q 超纯水仪，美国密理博公司。

盐酸，优级纯，国药集团化学试剂有限公司；茚三酮显色溶液套装、氨基酸混合标准溶液 B 型（批号 016-08641 ）、氨基酸混合标准品 AN-II 型（批号 015-14461 ）、 L - 天冬酰胺标准溶液（批号 016- 14131 ），和光纯药株式会社；氨基酸分析仪配套缓冲溶液，三菱化学株式会社； 5- 磺基水杨酸二水合物，批号 S112086-100g ，阿拉丁试剂（上海）有限公司； L - 谷氨酰胺，批号 G3126 ，美国 Sigma 公司。

16 批市售 JOL 制剂，江苏康缘药业股份有限公司，批号 190228 、 190328 、 191026 、 191123 、 191124 、 191203 、 191204 、 191205 、 191206 、 191207 、 191208 、 191209 、 101210 、 191211 、 191212 、 191214 ，编号分别为 S1 ～ S16 。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为日立 855-4507 型离子交换色谱柱（ 60 mm × 4.6 mm ， 3 μm ）；流动相为柠檬酸锂缓冲溶液；检测器为紫外检测器；洗脱泵体积流量 0.35 mL/min ；衍生泵体积流量 0.30 mL/min ；反应柱温 135 ℃（程序升温）；检测波长 570 、 440 nm ；进样量 20 μL ；分析时长 148 min 。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 按照氨基酸自动分析仪对样品的要求，进行样品前处理。取成品 2 mL ，加入等体积 5% 磺基水杨酸，在 4 ℃冰箱放置 24 h ， 12 000 r/min 离心 10 min ，取上清液加入等体积的 0.02 mol/mL HCl 稀释即为供试品溶液。

2.2.2 氨基酸标准溶液的制备 精密称取 L - 谷氨酰胺对照品 36.535 mg ，置 100 mL 量瓶中，加适量水，超声 5 min 使其溶解，用水定容至刻度，得 2.5 μmol/mL L - 谷氨酰胺对照品储备液；精密移取氨基酸混合标准溶液 B 型、 AN-II 型、 L - 天冬酰胺标准溶液和 L - 谷氨酰胺对照品储备液各 400μL ，置 10 mL 量瓶中，加适量 0.02 mol/L 盐酸稀释，超声 5 min 使其混匀，用 0.02 mol/L 盐酸定容至刻度，得 100 nmol/mL 的氨基酸标准溶液，即为标准品溶液 1 。

标准曲线溶液的配制：精密移取 6 mL 标准品溶液 1 ，以 0.02 mol/L 盐酸定容至 10 mL ，得含氨基酸标准品 60 nmol/mL 的标准品溶液 2 ；精密移取 5 mL 标准品溶液 2 ，以 0.02 mol/L 盐酸定容至 10 mL ，得含氨基酸标准品 30nmol/mL 的标准品溶液 3 ；精密移取 2 mL 标准品溶液 1 ，以 0.02 mol/L 盐酸定容至 10 mL ，得含氨基酸标准品 20nmol/mL 的标准品溶液 4 ；精密移取 5 mL 标准品溶液 3 ，以 0.02 mol/L 盐酸定容至 10 mL ，得含氨基酸标准品 15nmol/mL 的标准品溶液 5 ；精密移取 5 mL 标准品溶液 1 ，以 0.02 mol/L 盐酸定容至 100 mL ，得含氨基酸标准品 5 nmol/mL 的标准品溶液 6 。

2.3 特征图谱研究

2.3.1 JOL 氨基酸特征图谱的建立 16 批 JOL 分别按照“ 2.2.1 ”项方法制备 16 份供试品溶液，按“ 2.1 ”项分析条件依次进样检测，记录荧光色谱图。将生成的 16 批次色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（ 2004 A 版）”，生成对照指纹图谱（ R ），并计算各批次 JOL 氨基酸指纹图谱的相似度值。结果显示， 570 nm 下 16 批市售制剂指纹图谱之间的相似度在 0.989 ～ 1.000 ； 440 nm 下 16 批市售制剂指纹图谱之间的相似度在 0.998 ～ 1.000 ，结果见图 1 和表 1 ，说明市售 JOL 各批次间氨基酸指纹图谱相似度良好、批间差异小、质量较稳定。

2.3.2 JOL 氨基酸指纹图谱色谱峰的指认 取批次为 S1 的 JOL ，按“ 2.2.1 ”项方法制备供试品溶液，并按“ 2.2.2 ”项下方法制备混合氨基酸标准溶液，按“ 2.1 ”项分析条件依次进样检测，根据保留时间定性，将供试品溶液色谱图和对照品溶液色谱图进行对比分析，在 570 nm 下指认 27 个共有峰，在 440 nm 下指认了 2 个共有色谱峰；指认的色谱峰依次为 1 号峰磷酸丝氨酸（ P-Ser ）、 2 号峰牛磺酸（ Tau ）、 3 号峰天冬氨酸（ Asp ）、 4 号峰苏氨酸（ Thr ）、 5 号峰丝氨酸（ Ser ）、 6 号峰天冬酰胺（ Asn ）、 7 号峰谷氨酸（ Glu ）、 8 号峰谷氨酰胺（ Gln ）、 9 号峰肌氨酸（ Sar ）、 10 号峰甘氨酸（ Gly ）、 11 号峰丙氨酸（ Ala ）、 12 号峰瓜氨酸（ Cit ）、 13 号峰 α- 氨基丁酸（ α-ABA ）、 14 号色谱峰缬氨酸（ Val ）、 15 号色谱峰胱氨酸（ Cys ）、 16 号色谱峰异亮氨酸（ Ile ）、 17 号色谱峰亮氨酸（ Leu ）、 18 号色谱峰酪氨酸（ Tyr ）、 19 号色谱峰苯丙氨酸（ Phe ）、 20 号色谱峰 β- 丙氨酸（ β-Ala ）、 21 号色谱峰 β- 氨基丁酸（ β-AiBA ）、 22 号色谱峰 γ- 氨基丁酸（ γ-ABA ）、 23 号色谱峰鸟氨酸（ Orn ）、 24 号色谱峰赖氨酸（ Lys ）、 25 号色谱峰组氨酸（ His ）、 26 号色谱峰 3- 甲基组氨酸（ 3-Mehis ）、 27 号色谱峰精氨酸（ Arg ）、 28 号色谱峰羟脯氨酸（ Hypro ）、 29 号色谱峰脯氨酸（ Pro ），见图 2 。

2.4  29 种氨基酸同时定量测定

2.4.1 专属性考察 取批号为 190228 的 JOL ，按“ 2.2.1 ”制备供试品溶液，并取已配好的混合氨基酸标准溶液及空白试剂溶液，按“ 2.1 ”项分析条件依次进样检测，考察结果如图 3 所示，空白溶剂对定量氨基酸无干扰，将混合标溶液和供试品溶液对比，相邻的定量色谱峰之间无干扰，专属性良好。

2.4.2 线性关系及线性范围考察 按照“ 2.2.2 ”项下方法依次配制系列不同浓度的标准溶液，按“ 2.1 ”项分析条件依次进样检测，记录并分析定量成分的色谱峰面积。以氨基酸浓度为横坐标（ x ），色谱峰峰面积为纵坐标（ y ），对定量氨基酸成分进行线性 回归计算，得到各定量氨基酸的回归方程、相关系数和线性范围。用最低浓度的氨基酸标准溶液，以信噪比为