点评 | 袁国勇/朱轩（香港大学）、饶子和（清华大学）、蒋建东/李玉环（中国医学科学院）
在包膜病毒入侵宿主细胞的过程中，一些病毒能够借助其表面蛋白介导其包膜与宿主细胞膜融合，进而将遗传物质注入细胞开启感染进程。膜融合是病毒建立感染的关键环节之一。在冠状病毒家族中，这一环节由病毒表面刺突（Spike，S）蛋白介导完成。以新冠病毒为例，S1亚基产生构象变化，进而暴露出其受体结合域（RBD），并通过该结构域结合细胞受体。S1亚基与细胞受体的结合会触发S1亚基解离，当S2亚基中蛋白酶水解位点（S2’）被宿主蛋白酶切割后，S2亚基中的融膜肽（FP）弹出并插入宿主细胞膜，以此启动膜融合。最终，HR1形成三螺旋束， HR2则折叠成螺旋状，并与HR1三螺旋紧密结合，形成稳定的六螺旋束，促使病毒包膜与宿主细胞膜完成融合。近年来，众多研究团队成功揭示了SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2以及其他一些冠状病毒S蛋白的RBD与受体结合的复合物构象，以及S蛋白三聚体与受体结合的融合前构象。姜世勃、陆路等研究团队也发现了MERS-CoV（Nature Communications 2014）、SARS-CoV-2（Cell Research 2020）等S蛋白HR1/HR2形成六螺旋的融合后构象。不过，目前仍有一个关键问题尚未明确，那就是刺突蛋白从融合前状态转变为融合后状态时，究竟经历了怎样的构象变化。虽然已有研究者发现新冠病毒S2亚基中间态构象，但是对于早期的融合中间态，特别是介于受体结合和S1亚基脱落之间的S蛋白构象是否存在，及其变构细节等还一直处于认知盲区。因此，在膜融合起始阶段，出现了一系列亟待解答的重要科学问题。比如，融膜肽如何跨越病毒包膜和细胞膜之间的“长途”距离，有效插入细胞膜；为何S2’位点切割对于新冠病毒诱导的膜融合起着至关重要的作用；短暂暴露的S蛋白融合中间态构象是否存在新的广谱抗病毒药物靶点以及能否针对该类靶点设计新型药物。这些问题成为了该领域一直以来重点关注的焦点。2025年1月30日，复旦大学上海医学院陆路研究员、孙蕾研究员、姜世勃教授团队合作在Cell期刊以Research Article的形式，在线发表了题为Early fusion intermediate of ACE2-using coronavirus spike acting as antiviral target的研究论文。该研究发现了ACE2受体诱导的冠状病毒刺突蛋白早期融合中间态构象（E-FIC），并针对该中间态构象设计了高效、广谱、兼具失活病毒和抑制病毒感染的双功能抗冠状病毒候选药物。
传统观点通常认为，冠状病毒S1亚基在结合受体并脱落后，会触发S2亚基构象重排，进而暴露HR1结构域。因此，该研究对新冠病毒S蛋白是否存在介于ACE2受体结合和S1亚基脱落之间的特殊构象进行了探索。
团队首先利用利用流式细胞术，发现跨膜表达的S蛋白在受到ACE2蛋白胞外域的刺激后，能够结合HR1抗体或其配体多肽EK1，而此时S1亚基还没有脱落，提示可能存在一种不同于传统观点的早期融合中间态构象。为了捕获并直观地呈现S蛋白的这种中间态构象，研究团队对S蛋白与ACE2胞外域共孵育产物进行冷冻电镜颗粒筛选。通过长时间的摸索，研究者成功发现并解析了一种高分辨率（3.45 Å）的早期融合中间态构象（E-FIC）。在E-FIC中，S2亚基发生了构象转变，其中HR1三螺旋结构弹出，而S1亚基组成环状结构结合在S2亚基的底部。通过进一步的结构优化和分析，研究者发现在E-FIC S2亚基的HR1上结合着一段氨基酸序列（团队将其命名为中间态环——IL770）。值得注意的是，S2’位点就位于IL770中，且突出于结合表面形成隆起，这种结构特征有利于蛋白酶的切割。此外，通过上述构象可以推测蛋白酶对S2’位点的切割可能触发IL770从HR1表面剥脱，从而释放空间以利于HR2结合。通过对融合前和E-FIC结构的对比分析，研究者发现S蛋白结合ACE2受体后，S1亚基和S2亚基底部均会向细胞膜方向旋转以实现病毒膜和细胞膜初步拉近，这将有助于缩短融膜肽插入细胞膜所需的距离（图1）。
图1 SARS-CoV-2 S蛋白在诱导膜融合过程中经历的构象变化通过对E-FIC结构的分析，研究者发现S1亚基中的RBD与S2亚基中的HR1之间的空间距离被拉近，这一发现为靶向该中间体的药物设计提供了新思路（图2）。基于此构象，研究者选用了经临床试验证明具有较好活性和安全性的RBD结合药物候选（ACE2蛋白）和HR1的结合药物候选（EK1多肽），设计出双功能域串联药物候选。首先，由于E-FIC结构中HR1表面被IL770所结合，研究者通过竞争性结合实验发现，EK1多肽能够凭借强大的相互作用从IL770中夺取HR1进行结合。随后，为了验证双功能域之间最佳连接子长度，研究者通过表达含有2、5、6、7组连接子的蛋白进行活性筛选，发现由 5组连接子串联的蛋白（AL5E）具有最佳靶点结合活性和广谱性。后续研究结果表明，上述设计的蛋白类抗病毒活性分子具有双功能：（1）失活病毒功能：AL5E蛋白上的ACE2功能域诱导游离病毒表面的S蛋白形成融合中间态，该中间态暴露出靠近ACE2的HR1区，随后AL5E蛋白中的EK1功能域与HR1三聚体结合，造成病毒S蛋白锁定在融合中间态，使该病毒粒子丧失感染活性；（2）抑制病毒功能：AL5E蛋白上的ACE2功能域和EK1功能域也可分别作为抑制剂，抑制病毒对靶细胞的感染。AL5E对新冠病毒及其变异株的抑制活性比ACE2蛋白提高26至623倍，对游离病毒的失活活性提高21至754倍。此外，AL5E对其他使用ACE2受体的冠状病毒均具有很好的抗病毒效果。
图2 E-FIC中RBD与HR1之间的空间距离拉近同时，为了进一步探究所设计的双功能分子在体内的活性。该团队借助新冠病毒变异株BA.5.2和人冠状病毒NL63感染小鼠的模型，分别对AL5E蛋白在病毒感染治疗和病毒失活方面的效果展开了评估。结果显示，AL5E能够显著降低小鼠肺脏中病毒载量。这些研究不仅揭示了冠状病毒S蛋白在膜融合早期阶段经历的构象变化细节，还发现了其中的一些潜在药物靶点，为深入探索冠状病毒的膜融合机制及开发新型靶向性广谱药物或疫苗提供了新的思路。
复旦大学上海医学院陆路研究员、孙蕾研究员和姜世勃教授为本文的共同通信作者；复旦大学邢立晓博士后、刘治民博士、王欣玲青年研究员和刘倩莹博士为本文共同第一作者。
COVID-19大流行虽然过去，但是值得反思的是，世界在面对下一次大流行到来时是否仍然会措手不及，因为我们在面对突发传染病时缺乏有效的预防或治疗手段。冠状病毒在自然界中具有广泛的宿主分布，病毒外溢感染人类的风险很高。因此，针对冠状病毒共性机制进行研究并探索抗病毒药物或疫苗的靶点具有重要意义。冠状病毒S蛋白介导的膜融合对于病毒感染细胞至关重要。S蛋白通过S1亚基结合细胞受体后，为S2亚基的构象重排提供驱动力。S2亚基一旦受到触发，其中的HR1和CH形成的中央三螺旋会立刻弹出，将融膜肽插入宿主细胞膜中，原本处于S2亚基底部的HR2也折叠成螺旋状向上翻折与 HR1结合形成六螺旋束。HR1-HR2的相互作用将细胞膜和病毒膜拉近并融合在一起。在上述过程中，S蛋白三聚体与可溶性受体蛋白的结合、HR1-HR2 相互作用的融合后构象均得到了较为深入的研究。然而，S蛋白诱导膜融合的中间事件以及 S1与S2亚基是如何密切协作完成膜融合仍然迷雾重重。
陆路/孙蕾/姜世勃团队近期的研究成果为我们拨开迷雾，看到了S蛋白变构过程中一个关键的融合中间态构象。即 S 蛋白结合受体至 S1 亚基脱落之间并非一蹴而就，而是S1与S2亚基之间相互协作，逐步推进的。传统观点认为S1亚基脱落为S2亚基中HR1-CH弹出的驱动力。然而，该团队的研究发现，S1亚基在结合受体之后，会发生外旋现象，使得三聚体的中央孔隙变大，从而使得 HR1-CH 能从孔隙中顺利弹出。这一发现揭示了病毒潜在的“智慧”：一方面，病毒可利用S1亚基与受体结合所形成的复合物作为屏障阻挡宿主免疫系统对S2亚基“要害部位”的攻击；另一方面，还能借此拉近细胞膜和病毒膜之间的距离，为融膜肽顺利扎入细胞膜创造有利条件。总之，该团队的研究成果填补了S蛋白结合受体与S1亚基脱落之间变构过程的关键环节，让原本的 SARS-CoV-2 S蛋白在膜融合过程中构象变化过程更加完整清晰。这项研究不仅丰富了S蛋白诱导膜融合的变构细节，还拓展了S蛋白的可作用靶点范围，为研发靶向S蛋白融合中间态构象的疫苗或药物提供了坚实的科学依据。
囊膜病毒在入侵宿主时可能采取类似的病毒-宿主细胞膜融合机制：病毒表面糖蛋白结合宿主细胞的受体，启动病毒融合蛋白的一系列构象变化，促进病毒-宿主细胞膜融合，从而使病毒遗传物质能够进入宿主细胞内部。
1993年，姜世勃教授的团队发现一个衍生于HIV gp41 HR2区的多肽能高效地抑制病毒膜与宿主细胞膜的融合（Nature 365: 113, 1993），其专利转让给美国Trimeris制药公司开发出世界上首个基于病毒融合抑制剂的抗病毒多肽药物——恩夫韦肽（俗称T20）。他们推测该HR2多肽能与处于融合中间态的病毒gp41 HR1区结合，形成异源六螺旋体（6-HB），竞争性地抑制病毒gp41 HR2和HR1区结合形成同源6-HB，即融合后构象。1997年，Peter Kim的团队成功解析了HIV gp41 的融合后构象的晶体结构（Cell 89: 263, 1997），但至今还无人能够解析HIV gp41的融合中间态构象的高分辨结构。此后，国际上各团队先后发现了一系列靶向不同包膜病毒（SARS-CoV, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-OC43, SIV, RSV, EBOV, NiV, HeV, MeV, HPIV3, APMV-2, NDV, MuV, BIV）融合中间态构象的多肽融合抑制剂，但也未能获得出这些病毒表面/跨膜蛋白融合中间态构象高分辨率结构。目前，囊膜病毒蛋白融合前及融合后构象的高分辨结构已有许多报道，而融合中间态仅有少数低分辨率结构得以解析，高分辨率原子结构尚无报道。捕捉膜病毒蛋白融合中间态构象，并解析其高分辨原子结构，是一个极具挑战性的科学难题。
近期，复旦大学陆路研究员、孙蕾研究员和姜世勃研究员团队成功捕捉了新冠病毒刺突（S）蛋白的早期融合中间态构象，并首次解析了其高分辨率结构，揭示了全新的干预靶点。
新冠病毒感染宿主时，病毒粒子通过表面的刺突蛋白S三聚体识别细胞表面受体ACE2，介导病毒进入宿主细胞。S包含S1和S2两个结构域。当前的膜融合模型认为：当受体结合后，覆盖在S2上的S1会发生构象变化并脱落，暴露出S2。S2会伸展到宿主细胞膜并插入融合肽 (FP)，将病毒和宿主细胞膜连接。随后，S2重新折叠和压缩，变换成为类似棒状的六螺旋束的融合后构象，介导膜融合的过程。
团队将SARS-CoV-2 S与ACE2在不同条件下共同孵育，通过大量筛选，首次捕捉到了S的一种新型的早期融合中间态构象 (E-FIC)，并解析了其高分辨结构。结果显示，与之前提出的膜融合模型不同，在E-FIC中，形成环状结构的S1并没有脱落，而是通过旋转和开放，中间形成一个孔道。同时，S2亚基发生重大形变， HR1-CH从孔道中突起，形成三螺旋结构，而IL770 (intermediate loop 770, aa770-831)镶嵌在其凹槽处。值得注意的是：IL770上有一个远离三重轴的柔性凸起，正是S2’位点所在之处。因此，该中间态结构在三个方面有重要意义：1）揭示了融膜肽FP插入宿主膜的机制：未脱落的S1-ACE2可帮助FP插入到宿主膜；2）揭示了融合前构象中隐藏的S2’位点如何暴露，有利于TMPRSS2/CTSL酶的切割；3）该高分辨率结构，揭示了新的抗病毒干预靶点。
基于结构，团队设计了一种以E-FIC为靶标的双功能抗病毒蛋白——AL5E（ACE2-(G4S)5-EK1)，可同时靶向RBD和HR1。结果发现AL5E能有效抑制受体为ACE2的冠状病毒的感染，效果远远优于单功能抗病毒药物。
新冠病毒S融合中间态E-FIC的发现，不仅补充了利用ACE2的人冠状病毒 （包括SARS-CoV和SARS-CoV-2）S蛋白融合前后之间的缺失部分，加深了对膜融合机制的理解，也为新型抗病毒药物和疫苗的研发开辟了新的方向。此外，该研究也为其他囊膜病毒的膜融合机制提供了新的思路。
抗病毒药物的研发对于防控病毒引发的重大传染病至关重要。当前开发的抗病毒药物主要靶向病毒的非结构蛋白如蛋白酶、聚合酶等以及结构蛋白如包膜蛋白等。如何在现有靶点的基础上挖掘新的药物靶点，进而设计和研发出高效、广谱抗病毒药物一直是该领域长期以来重点关注的核心问题，也是我们正在开展的国家自然科学基金重大项目“RNA病毒性传染病广谱治疗药物创新基础研究”的主要目标。此项目致力于在该关键领域实现突破，为未来抗病毒药物的发展提供坚实的理论基础和创新思路。
冠状病毒刺突（S）蛋白可介导病毒的入侵，虽然已有多项研究报道了靶向S蛋白RBD、HR1、FP、Stem Helix等靶点的抗体和多肽等抑制剂。然而，S蛋白如何从融合前构象（Pre-FC）转变为融合中间态构象（FIC）和融合后构象（Post-FC），特别是在融合中间态构象中是否存在新的药物研发靶点，仍是本领域亟待解决的关键科学问题。
复旦大学陆路/孙蕾/姜世勃团队采用创新的研究设计方案，以新冠病毒的受体ACE2 蛋白对该病毒S 蛋白进行激发，成功捕获到S 蛋白的早期融合中间态（E-FIC）。出乎意料的是，E-FIC 中S1 亚基并未像之前广泛认为的会快速脱落，而是继续存在于E-FIC中。此时S2亚基中的HR1结构域已弹出，形成HR1三聚体，与IL770区域（aa770-831，包含S2’酶切位点）结合，从而展现出一些以前从未报道的全新药物或疫苗靶点。
陆路/姜世勃团队前期基于预测的HIV-1 跨膜蛋白gp41 的融合中间态构象（FIC）和HIV-1 的CD4 受体，设计了高效的HIV 感染失活剂（简称“病毒失活剂”），并系统地构建起研发病毒失活剂的理论和技术体系。因为新冠病毒S蛋白E-FIC 含有尚未脱落的S1 亚单位受体结合域（RBD），以及部分暴露的S2亚单位中的HR1区域。基于此，该团队设计并构建了靶向E-FIC 的重组蛋白—AL5E（ACE2-Linker-EK1）。其中的ACE2能够特异性地与E-FIC中的S1亚基上的RBD结合，而EK1（作为靶向HR1的通用冠状病毒融合抑制剂）能与S2亚基上的HR1结合，通过这种诱导融合中间态构象的形成，并锁定该中间态构象的连续结合作用，使得病毒丧失感染活性。研究证明，AL5E对于使用ACE2受体的冠状病毒均展现出高效且广谱的失活活性。不仅如此，在两种冠状病毒（SARS-CoV-2 BA.5.2和HCoV-NL63）感染的小鼠模型实验中，AL5E表现出了治疗和预防的双重功能。
总之，本项研究成果显著。一方面，成功揭示了新冠病毒S 蛋白介导的早期融合中间态构象和潜在药物靶点；另一方面，针对该靶点设计出高效、广谱双功能冠状病毒失活剂。与传统抗病毒药物的作用机制（主要靶向病毒进入细胞后所产生的蛋白酶或靶向介导病毒入侵靶细胞的蛋白）不同，而本研究设计的病毒失活剂，可在病毒感染细胞之前，直接作用于游离的病毒颗粒，使其迅速失活。这一特性可能对阻断病毒传播具有重要意义，也为广谱抗病毒药物的研发开辟了新路径。
展望未来，在应对新发与再现的高致病性病毒所引发的传染病时，单一药物往往难以满足需求。我们可能需要联合使用多种不同机制的药物，如病毒失活剂、病毒入侵阻断剂、病毒复制抑制剂、靶向宿主蛋白的抑制剂、以及能够提升或重塑免疫力的药物等。通过这种多药物组合的方式，有望实现高效、广谱、抗变异的防治效果，从而有效应对当前已流行或未来可能爆发大流行的病毒性传染病。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.01.012
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