CRISPR相关转座子（CAST）通过CRISPR系统实现RNA介导的大片段DNA定向移动。整个过程避免了暴露断裂的DNA双链，并且不依赖细胞自身的同源重组修复机制，这使得CAST系统在生物医学研究和遗传病治疗中具有巨大的应用潜力。CAST系统主要来源于Tn7-like转座子家族。近年来，研究人员对不同类型的CAST系统（如V-K【1】、I-B【2】和I-F【3】）的分子机制有了深入理解【4】。虽然这些系统在招募蛋白质的方式上有很大差异，但它们的核心机制类似：CRISPR模块首先精准识别靶位点，接着核酸酶TnsA和转座酶TnsB识别并切割转座子DNA的末端。在调控蛋白TnsC的帮助下，转座子DNA被准确插入靶位点。CRISPR模块与转座模块通过TniQ蛋白（TnsD同源蛋白）连接，从而实现了RNA介导的转座过程。此前的研究多集中于CRISPR模块如何识别靶点并通过TniQ连接两个功能模块【5-14】。虽然V-K CAST系统完整转座复合体的结构在之前已经被解析【15】，但由于该系统缺少大部分系统中都存在的核酸酶TnsA，无法完全解释TnsA、TnsB和TnsC在转座过程中的合作机制。此外，某些CAST系统（如I-B和I-D【16,17】）保留了Tn7系统中由TnsD介导的DNA整合方式，TnsD如何识别特定DNA序列并招募TnsABC复合物，仍需进一步研究。2024年10月8日，美国普渡大学畅磊福研究团队在Cell杂志上发表了题为 Structure of TnsABCD transpososome reveals mechanisms of targeted DNA transposition的研究论文【18】。该研究以来自地衣中的蓝细菌共生体Peltigera membranacea cyanobiont 210A 的I-B 型CAST（PmcCAST）为研究模型，通过冷冻电镜（cryo-EM）和生化分析的方法，首次揭示了TnsD如何识别特定的tRNA-Val基因并招募TnsABC蛋白复合体，完成定点的DNA插入。结合2023年（详见BioArt报道：Cell | 畅磊福团队解析I-B型CRISPR系统引导Tn7-like转座子的分子机理）报道的PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC复合体的结构模型【14】，团队搭建了完整的PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC-TnsAB复合体的结构模型，并对两种DNA 整合机制的效率和特异性进行了比较和讨论。团队在Tn7-like转座复合体TnsABCD-DNA和TnsC-TnsD-DNA的分子结构中发现了很多有趣的分子间相互作用。这一研究成果不仅为CAST系统的开发应用提供了新思路，还进一步加深了对转座机制的理解。值得一提的是，TnsABCD介导的转座是经典的Tn7-like转座子通路，从Tn7早期研究至今已有30余年历史，而本研究首次解析了该完整复合体的结构。
（1） 在TnsC-TnsD-DNA复合体和TnsABCD-DNA复合体中，靶标DNA（Target DNA）都呈现出弯曲状态。特别值得注意的是，TnsD中的R445氨基酸残基嵌入CC/GG碱基对之间，进一步影响DNA的形变。当R445突变成丙氨酸后，转座活性显著下降，且在TnsC-TnsDR445A-DNA的冷冻电镜结构中，TnsD的C端识别序列的结构域不再可见。这表明，R445残基嵌入DNA对于识别靶序列和形成稳定的TnsC-TnsD-DNA复合体至关重要。
（2） TnsC通过与TnsB的C端尾部相互作用，招募TnsB参与转座过程。在TnsC的七聚体中，有4个亚基显示出多余的TnsB的C端尾部的密度图。这表明，形成稳定的TnsC七聚体对于有效招募TnsB十分重要。
（3） TnsC的C端尾部位于TnsA、TnsB和DNA的交界处，直接参与了TnsAB-DNA链转移复合物（Strand transfer complex）的组装，且相互作用的氨基酸在I-B型CAST系统中具有保守性。
（4） TnsA的核酸酶结构域与TnsB的RNaseH-like结构通过延伸的β折叠片相互作用。TnsA的DNA底物在–3和–4之间的磷酸二酯键离其活性中心最近。这一结构观察与先前原始Tn7的生化数据显示的TnsA和TnsB切割位点相差3个碱基的结果相一致。
（5） TnsD介导的DNA整合与RNA介导的DNA整合在靶标DNA的识别区域上有所不同，导致插入位点与识别位点之间的距离差异。这两种整合方式效率的不同，可能与TnsC七聚体的稳定性有关。在TnsD介导的整合中，TnsD与TnsC存在两个接触面，且DNA的嵌入可能进一步增强了TnsC在目标DNA上的稳定性。
总之，本研究加深了我们对Tn7-like转座子和CAST系统中DNA靶向插入的结构和机制的理解，为将该系统开发成精准DNA插入工具的研究奠定了基础。普渡大学副教授畅磊福为该论文的通讯作者，博士生王淑堃为该论文的第一作者。博士生Romana Siddique， 普渡大学副教授Mark Hall，以及芝加哥大学教授Phoebe Rice参与了研究工作。https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.023
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