【案例解析】黑磷量子点修饰的 ADSCs 疗法：破解牙周炎骨质流失难题

EngineeringForLife · 公众号 · · 2025-02-06 00:00

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牙周炎是一种慢性、破坏性和炎症性疾病，是牙齿脱落的重要原因。现有的临床治疗方法可以减缓牙周炎的进展，但在炎症微环境中实现牙槽骨缺损修复仍面临巨大困难。研究表明有效 减少 M1 表型的巨噬细胞并增加 M2 巨噬细胞极化的激活有利于骨再生。从脂肪组织的基质血管分离的脂肪来源的间充质干细胞（ADSC） 由于其良好的可及性和多能性，在再生医学中具有巨大的潜力。黑磷 （BP）纳 米材料 具有良好的光学性能、拓扑特征和生物降解性，广泛应用于药物递送、光热疗法、光动力疗法、生物成像和癌症治疗。BP 量子点（BPQD）是一种新的 BP 纳米结构，表现出独特的光学和电子特性，具有 更低的细胞毒性和更高的生物相容性 。然而，BPQDs 在牙周炎牙槽骨修复中的作用及其机制仍不清楚。

本期，EFL以发表在杂志 《Mater Today Bio》 的 “Black phosphorus quantum dot-modified ADSCs as a novel therapeutic for periodontitis bone loss coupling of osteogenesis and osteoimmunomodulation” 研究为例，解析如何用 黑磷量子点（BPQD）处理的脂肪来源的间充质干细胞（ADSC） 促进 成骨分化 。

1. 为什么选择黑磷量子点（BPQD）

选择黑磷量子点（BPQDs）作为骨再生领域的研究对象，主要基于其独特的 物理化学性质和生物相容性 。首先，BPQDs是黑磷纳米材料的一种新型结构，具有量子限制效应和边缘效应，使其展现出卓越的光学和电子特性。这些特性使 BPQDs在药物递送、光热疗法等方面具有潜在优势 。此外，BPQDs在生理环境下能自我降解为无毒的磷酸根离子，磷酸根离子作为骨组织的天然组成成分，有助于促进骨细胞的矿化和再生，从而对骨再生具有良好的生物活性。

与传统的BP纳米片相比， BPQDs的尺寸较小，表现出更低的细胞毒性和更高的生物相容性，这使其成为一种理想的骨再生材料 。尤其在牙周炎等骨修复应用中， BPQDs可能通过促进细胞增殖、分化及局部矿化来加速牙槽骨的修复过程 。因此，BPQDs在骨组织工程中展现出巨大的应用潜力，尤其在促进牙周炎牙槽骨修复方面，值得进一步探索其机制和效果。

2. 如何制备BPQD

（1）将 30 mg 散装 BP 粉末与 25 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）分散。使用超声细胞破碎系统和 1200 W 声波探针对混合物进行 3 小时的超声处理。

（2）在冰浴中以 300 W 的功率对分散液进行过夜超声处理。然后将获得的分散液以 7000 rpm 离心 20 分钟，并倾析含有 BPQD 的上清液。

（3）最后，将收集的溶液以 13,000 rpm 离心 45 分钟，然后重新悬浮于超纯水中以备进一步使用。

图1 BPQD的制备和应用示意图

3.BPQD的优势和作用

（1）BPQD 的体外生物相容性

ADSCs 是长纺锤形细胞， 具有典型的成纤维细胞形态，成骨分化和成脂分化能力 。为了研究BPQD 修饰的 ADSCs 的生物相容性，用钙黄绿素-AM/PI 对 ADSCs 进行染色， 在每个样本中观察到的死细胞很少 。用鬼笔环肽对不同浓度 BPQDs 培养的 ADSCs进行染色，发现 ADSCs 的延伸程度和黏附在样品间没有明显差异 。CCK-8结果显示，用 BPQDs 处理的 ADSCs在 1 、 3 和 5 天时没有显著差异（图 2）。以上结果表明BPQD 在体外具有较好的生物相容性。

图2 BPQD 的体外生物相容性检测

（2） BPQD 修饰的 ADSCs 通过 Wnt/β-catenin 和 BMP2/SMAD5/Runx2 信号通路加速成骨作用

ALP 染色和 ALP 活性分析显示，0.1 和 1 μg/ml BPQDs 修饰的 ADSC 组的 ALP 染色水平明显升高。使用 ARS 染色结果表明 1 μg/ml BPQD 修饰的 ADSC 组呈现深红色。此外，通过 qPCR 检测发现，1 μg/ml BPQD 修饰的 ADSC 组中 5 个成骨基因（COL1 、 OPN 、 Runx2 、 osteomodulin 和 OCN）的表达升高。Western blot 检测发现 ALP 、 Runx2 和 OCN表达显著增加，这些结果表明， BPQDs 修饰 ADSCs 可加速成骨效应 。Wnt/β-catenin 和 BMP2/SMAD5/Runx2是成骨作用的重要信号通路。qPCR结果发现，使用 1 μg/ml BPQDs 修饰 ADSCs 可显著促进 β-catenin 、 C-myc 、 TCF-7 、 BMP2 和 SMAD5 的表达。Western blot 分析进一步表明，β-catenin、pGSK3β、BMP2 和 SMAD5 的表达升高。免疫荧光染色结果表明，BPQD 修饰 ADSCs上调 β-catenin、SMAD5 和 Runx2 的表达。这些结果表明， 使用 BPQDs 修饰 ADSCs 可以在不添加成骨诱导培养基的情况下通过 Wnt/β-catenin 和 BMP2/SMAD5/Runx2 信号通路加速成骨诱导效应（图3） 。

图3 BPQD 修饰的 ADSCs 通过 Wnt/β-catenin 和 BMP2/SMAD5/Runx2 信号通路加速成骨作用

（3）BPQD 修饰的 ADSC 对巨噬细胞极化的调节

巨噬细胞激活的 M1 表型分泌大量的促炎细胞因子，可引起慢性炎症并阻碍骨再生，M2 表型可以产生大量的抗炎细胞因子来促进成骨分化。用 BPQD 修饰的 ADSC CMs 处理巨噬细胞系 RAW 264.7，qPCR 结果显示，CM-BPQDs-ADSC 组的 CD206、Arg-1 和 IL10 表达高于 CM-ADSC 组，而 CD86、IL6 和 iNOS 的表达低于 CM-ADSC 组。Western blot 分析进一步证实，在 LPS 培养条件下，CM-BPQDs-ADSCs 显著抑制 iNOS 、 IL1β 和 TNFα 的表达，但与其他组相比，促进了 RAW 264.7 中 Arg-1 和 IL10 的表达。iNOS 阳性细胞的百分比较低和 Arg-1 阳性细胞的百分比较高。以上结果表明， BPQD 修饰的 ADSCs 可以通过旁分泌途径推动 M1 巨噬细胞向 M2 的转化（图4） 。

图4 用 BPQD 修饰的 ADSC 条件培养基培养后巨噬细胞极化的调节

（4）在牙周炎微环境中用 CM-BPQDs-ADSCs对BMSCs行为和成骨效应的影响

在 LPS 模拟炎症微环境中，transwell 结果显示，与 CM-ADSCs 和对照相比，CM-BPQDs-ADSCs 提高了 BMSCs 的迁移能力，可能有利于 BMSCs 归巢于炎症性骨缺损区域。共培养 7 天后，与对照组和 CM-ADSC 组相比，CM-BPQDs-ADSCs促进了 BMSCs 中 ALP 的表达和活性，矿化结节形成明显增加，与 CM-BPQDs-ADSCs 共培养的 BMSCs中COLI、OPN、Runx2、osteomodulin、OCN、β-catenin、BMP2 和 SMAD5的基因和蛋白表达更高。上述结果显示， BPQD 修饰的 ADSCs 可通过牙周炎微环境中的旁分泌通路促进 BMSCs 的成骨作用 ，这与 Wnt/β-catenin 和 BMP2/SMAD5/Runx2 信号通路调节有关（图5）。

图5 牙周炎微环境中BPQD 修饰ADSC 条件培养基对BMSCs细胞行为和成骨作用的影响

（5）牙周炎微环境中体内骨缺损修复的结果

该研究设置了 GelMA水凝胶组(Gel)、GelMA水凝胶+ ADSC组 (ADSCs/Gel)和 GelMA水凝胶+ bpqd修饰后的ADSC组 (BPQDs/ADSCs/Gel)三组对照实验。实验结果表BPQDs/ADSCs/Gel组骨骼的生长程度高于其他组， BV/TV 和 BMD 最高。H&E 和 Masson结果显示，BPQDs/ADSCs/Gel组形成了大量骨组织， 其骨结构比其他组观察到的更致密，具有明显更多的胶原纤维形成 。免疫荧光染色结果显示，BPQDs/ADSCs/Gel组骨组织中成骨标志物包括 Runx2 和 OCN 表达最强。Arg-1 阳性细胞更多，iNOS 阳性细胞较少。 血管生成标志物包括 CD31和 VEGF的表达较高（图6-7） 。

图6 牙周炎微环境中体内骨缺损修复的结果

图7 体内牙周炎微环境中的骨免疫调节和血管生成效应

综上所述， 由GelMA水凝胶递送的 BPQD 修饰的 ADSCs 在牙周炎微环境下，通过促进成骨分化和调节骨免疫平衡来加速体内牙周炎微环境中的骨再生，促进巨噬细胞通过牙周炎微环境中的旁分泌途径从 M1 表型向 M2 表型极化。 证明 BPQD 修饰的 ADSCs 可以通过内源性成骨分化和外源性旁分泌途径调节成骨和骨免疫之间的串扰来提高牙周炎微环境中骨缺损的修复。 GelMA水凝胶在该研究中起到了良好的递送载体作用！

参考资料：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2024.101122

本文所用EFL产品

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)

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