Plus深读| piRNA：异染色质中活跃转录的“暗夜舞者”

http://dx.doi.org/10.1038/nature23482

很多真核生物的基因组中都有转座子，如酵母，拟南芥，果蝇，小鼠，人等。为了防止转座子激活引起基因组突变，很多物种都利用piRNA（PIWI-interacting RNA）来抑制转座子活性，该手段在生殖细胞中尤为常用 ^[1-3] 。

piRNA是一种21-30nt的单链RNA，它可以结合逆转座子（retrotransposon）的RNA，并招募PIWI蛋白复合物来降解逆转座子RNA。此外，piRNA还可以入核，招募相关蛋白在转座子的DNA上形成异染色质，从而彻底关闭转座子 ^[1-3] 。

piRNA转录自基因组上的piRNA簇，它们常常位于转座子较多的位置（一种观点认为，当转座子插入piRNA簇时，piRNA的转录就会激活） ^[4-6] 。那么当piRNA激活后，这些转座子较多的位置（包括piRNA簇）就会被加上H3K9me3修饰，HP1或其同源蛋白会辅助形成异染色质，抑制转录 ^[6,7] 。然而有趣的是，piRNA却能在该异染色质中转录。在果蝇中，piRNA的转录需要HP1同源蛋白Rhino的参与 ^[6,7] ，但具体机制尚不明确。

果蝇的piRNA通过Pol II进行转录，转录方式有两种模型。第一种模型是piRNA利用上游基因的转录信号延续转录。的确有一些piRNA簇的上游有基因表达，并且Rhino蛋白的互作蛋白Cutoff也确实会抑制上游基因转录的终止（见图1左） ^{[8, 11]} 。 第二种模型是Pol II直接在piRNA簇中起始转录 （图1右）。 本研究发现了第二种模型的机制。

图 1 piRNA转录的两种模型

首先，为了研究piRNA簇 cluster42AB 的转录，到底是延伸自上游基因Pld，还是直接在piRNA簇内起始，研究者利用CRISPR-Cas9将Pld的启动子切除，利用small-RNA seq (sRNAseq)发现 cluster42AB 的转录没有减弱（反而略有增强）。利用ChIP-seq发现Rhino蛋白在 cluster42AB 的结合也没有减弱（图2a）。这说明 cluster42AB 的转录不依赖于上游Pld的转录。进一步研究发现， cluster42AB 中存在很多“YR”双核苷酸，这是转录起始蛋白TFIID的结合序列（图2b, 2c）， 提示 cluster42AB 内可以起始转录 。

图 2 piRNA簇内可起始转录

为了研究果蝇异染色质中piRNA转录所依赖的蛋白，该研究组首先进行了大规模的RNAi筛选（发表于Mol Cell 2013），发现piRNA转录需要蛋白CG12721参与 ^[12] 。利用PSI-BLAST匹配，研究者发现CG12721可能是转录起始蛋白TFIIA-L的旁系同源蛋白（paralogue）（图3a），研究者将其命名为“Moonshiner”。不同于广泛表达于各组织的TFIIA-L和TFIIA-S，Moonshiner只在果蝇卵巢中表达。在卵巢组织中进行co-IP Western Blot和co-IP质谱，发现Moonshiner可以和转录起始蛋白TRF2、TFIIA-S，以及异染色质蛋白Deadlock互作；TRF2可以和TFIIA-L，TFIIA-S以及Moonshiner互作（图3b, 3c, 3d）。在果蝇卵巢中的免疫荧光实验也证明，Moonshiner和异染色质蛋白Rhino、Deadlock共定位（图3e），Deadlock的定位依赖于Rhino，而Moonshiner的定位依赖于Deadlock和Rhino（图3f, 3g）。

因此，研究者提出了如下模型：异染色质中，组蛋白修饰 H3K9me3招募异染色质蛋白Rhino及其相关蛋白Deadlock ，然后Deadlock 招募Moonshiner、TFIIA-S、TRF2作为转录起始机器，在piRNA簇内起始转录 （模式图见图4）。在表型上，敲低 rhino，moonshiner，TFIIA-S 或Trf2 ，都会导致生殖细胞转座子的激活，以及后代果蝇胚胎不能孵化。

图 3 piRNA簇内起始转录的新机器。

a, Moonshiner和TFIIA-L的同源性；b,c, co-IP/质谱结果，LAP是由3 × Flag–V5–GFP组成的标签蛋白；d, co-IP Western Blot结果，IN=input，UB=未被IP下来的蛋白，IP=IP下来的蛋白。

图 4 模式图：piRNA簇内转录起始的新机制

为了验证以上模型，研究者在 moonshiner 敲除及 rhino 敲除的果蝇卵巢中研究piRNA簇的转录情况。他们发现敲除 moonshiner 或 rhino ，piRNA cluster80F 和 cluster42AB 的转录均被关闭（RNA-seq或FISH），Pol II的结合显著下调（ChIP-seq）（图5a-5d）。这说明Rhino结合的异染色质中的 piRNA簇的转录，需要Moonshiner的参与。

图 5 Rhino结合的piRNA簇的转录需要Moonshiner的参与

研究者在 rhino 或 moonshiner 敲除的果蝇卵巢中，检测了多种piRNA簇的转录，发现piRNA cluster38C1/2 的转录依赖Rhino却不依赖Moonshiner。敲除 moonshiner 后， cluster38C1/2 的转录上升了（图6a）。其中 cluster38C1 在敲除 moonshiner 后，转录上调了约10倍（图6b, 6c）。进一步研究发现，这是由于 cluster38C1 的上下游各有一个启动子，分别负责正负链的piRNA簇的转录。在敲除两侧启动子后，piRNA簇的转录下调了4倍，但仍有转录（图6d, 4f）。而若在敲除两侧启动子的基础上，再敲除 moonshiner ，则piRNA簇不再转录（图6e）。而若只敲除一侧启动子，该启动子负责的转录部分下调，另一条链的转录部分上升；若再敲除 moonshiner ，该启动子负责的piRNA转录会被关闭，而另一条链的转录会大大增强（图6d, 6e）。

图 6 部分piRNA簇可利用启动子替代Moonshiner的启动转录

该实验说明一些拥有启动子的piRNA簇可以不依赖Moonshiner起始转录，但该转录仍需要Rhino的参与。在没有启动子的情况下，piRNA簇会依赖Moonshiner起始转录，但转录效率低于启动子。（ 更详细的讨论见延伸思考 ）。

研究者通过co-IP发现Deadlock可招募转录起始机器Moonshiner、TFIIA-S和TRF2，在piRNA簇内起始转录。那么Moonshiner的具体作用是什么呢？研究者猜想，如果在缺失Moonshiner的情况下，直接把TRF2招募到异染色质上Deadlock的结合位点，可不可以启动piRNA簇转录呢？为了验证该猜想，研究者将TRF2融合表达GFP，并将Deadlock融合表达结合GFP的微抗体，这样就可以在缺失Moonshiner的细胞中，让TRF2直接被招募到Deadlock结合位点上（模式图见图7a）。

实验证明，该系统的确可以在Moonshiner缺失的情况下，将TRF2招募到Rhino结合的异染色质上（图7b），重启piRNA簇的转录（图7e），抑制转座子活性（图7d），并且回复果蝇胚胎的原肠胚形成率（图7c）。这说明 Moonshiner的作用是将TRF2招募到Rhino和Deadlock结合的异染色质上，启动piRNA簇转录，抑制转座子活性。

图 7 Moonshiner通过将TRF2招募到Rhino结合位点，促进异染色质区的piRNA转录

综上所述，研究者发现了果蝇生殖细胞中，异染色质上的piRNA转录的机制： 组蛋白修饰H3K9me3招募异染色质蛋白Rhino（HP1同源蛋白）及其相关蛋白Deadlock，进而Deadlock招募Moonshiner、TFIIA-S、TRF2作为转录起始机器，在piRNA簇内起始转录。

该机制 不同于经典的DNA序列依赖的转录起始机制 （转录起始机器识别增强子和启动子的DNA序列，起始转录，如图8左），而是 依赖于组蛋白修饰H3K9me3来进行转录起始 ，与拟南芥中的小RNA前体（small RNA precursor）的转录起始机制类似（图8右）。 该研究提出了组蛋白修饰调控转录的新机制 。

图 8 DNA序列依赖的经典转录起始机制，以及组蛋白修饰依赖的转录起始机制

延伸思考

1. 众所周知，常染色质区的染色质更加开放，利于转录机器结合，基因可以活跃转录。而异染色质区的染色质固缩，一般认为转录难以发生。而该研究发现的H3K9me3依赖的转录起始机制，拓展了我们的视野， 为异染色质区的转录发生提供了新机制 。后面可以围绕 异染色质的物理结构、转录因子的结合方式、转录的发生方式，以及异染色质转录时的染色质结构的动态变化 ，进行 生物物理学 的研究。

2. 经典的转录起始模型是，转录机器识别转录调控元件的DNA序列，起始转录。组蛋白修饰可以通过调控转录起始元件的活性、可及性（accessibility），来调控转录。而本文发现了 组蛋白修饰直接招募转录起始机器的新机制 。其实，DNA序列招募转录相关蛋白，本质上是DNA与蛋白质的 氢键和范德华力等信的识别与建立 。而染色质修饰也可提供蛋白质结合的 分子间作用力 ，或许也可直接招募转录因子与转录机器。因此， 从本质意义上来看，这种机制并不令人吃惊 。

3. 该研究还发现了一些有启动子的piRNA，可以利用启动子，而不依赖Moonshiner进行转录。在这种情况下，敲除moonshiner甚至可以大大增强转录。若只敲除一侧启动子，再敲除moonshiner，该启动子负责的piRNA转录会被关闭，而另一条链的转录会大大增强。这提示我们，可能在 有启动子促进转录的情况下，Moonshiner会限制转录活性在合理范围内 ，缺失Moonshiner会使得启动子起始的piRNA转录过度活化。那么该过程是怎么发生的呢？ Moonshiner的缺失是否会使得该区域的染色质被打开，从而使得启动子活性增强呢？ 相关机制值得进一步研究。

   
   

4. 本研究发现的一些启动子起始的piRNA转录，仍需要Rhino的参与，Rhino可能不通过Moonshiner，而通过其他机制启动转录。那么这种转录是如何在异染色质中发生的呢？这也可进一步研究。