【分享】学霸整理的 PCR 资料

生物学霸 · 公众号 · 生物 · 2025-01-04 15:58

正文

来源：丁香园论坛

我整理的 PCR 资料. 供大家分享.

PCR 实验技巧

增加 PCR 的特异性：
1. prime 理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件
a. 足够长,18-24bp, 以保证特异性. 当然不是说越长越好, 太长的引物同样会降低特异性, 并且降低产量
b. GC% 40%～～～～60%
c. 5' 端和中间序列要多 GC, 以增加稳定性
d. 避免 3' 端 GC rich, 最后 3 个 BASE 不要有 GC, 或者最后 5 个有 3 个不要是 GC
e. 避免 3' 端的互补, 否则容易造成 DIMER
f. 避免 3' 端的错配
g. 避免内部形成二级结构
h. 附加序列 (RT site, Promoter sequence) 加到 5' 端, 在算 Tm 值时不算, 但在检测互补和二级结构是要加上它们
i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表, 注意生物的偏好性, 不要在 3' 端使用兼并引物, 并使用较高的引物浓度 (1uM-3uM)
j. 最好学会使用一种 design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
设定 Tm 有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于 18 碱基的引物。
有的是根据 GC 含量估算 Tm。确定引物 Tm 最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm 会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的 Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的 Tm5℃，以 2℃ 为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的 Tm 值。引物对的 Tm 差异如果超过 5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低 5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers
定制引物的标准纯度对于大多数 PCR 应用是足够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在 TE 重溶引物，使其最终浓度为 100μM。TE 比去离子水好，因为水的 pH 经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于 10μM 浓度溶于 TE 的引物在 -20℃ 可以稳定保存 6 个月，但在室温（15℃ 到 30℃）仅能保存不到 1 周。干粉引物可以在-20℃ 保存至少 1 年，在室温（15℃ 到 30℃）最多可以保存 2 个月。

3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg2+离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响 Polymerase 的活性，一般的情况下 Mg2+的浓度在 0.5-5 mM 之间调整，同样要记住的是在调整了 dNTPs 的浓度后要相应的调整 Mg2+离子的浓度，对实时定量 PCR，使用 3 到 5 mM 带有荧光探针的镁离子溶液
b. 其他的离子
NH4+ K+都会影响 PCR，增加 K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度, 从而降低了 PCR 的严谨性 (stringency)，NH4+也有相同的作用. 当然, 过高的阳离子浓度 (KCL>0.2M) 时, DNA 在 940C 根本不会发生变性, 当然也就无从谈起 PCR 了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同, 需要 operator 自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于 Taq polymerase, 所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的情况下, 变性的温度可以使用 90～920C, 变性的时间也可以缩短, 从而保证 polymerase 的活性
d. template
50ul PCR SYSTEM
human g DNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
Lamada DNA 0.5ng-5ng
Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
常规是 940C 5 分钟, GC Rich 的摸板是 950C 5 分钟
除了 GC Rich 外, 常规的 APPLICATIONS 可以将这部分时间缩短到 1 到 2 分钟, 或者在 CYCLE 1 时给予较长的时间, 而取消开始的 denaturation
b. annealing
重点到了：一般情况下, 是从 55 度开始. 根据情况配合以 Mg 离子浓度进行调整. 有条件的可以做 gradient PCR. 退火的时间在 30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 annealing temp. 时也会有一些活性. 所以在 A.T. 的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外, 在对于一些困难户, 比如从 gDNA 里扩增大片段, 还可使用 two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很简单, 但的确是一个很有用的方法。举个例子，ANNEALING TEMP. 55 度
940C 5 min 940C 30s 600C 30s 720C 1 min 2cycles 940C 30s 590C 30s
720C 1 min 2cycles 940C 30s 580C 30s 720C 1 min 2cycles 940C 30s
510C 30s 720C 1 min 2cycles 940C 30s 500C 30s
720C 1 min 20cycles 720C 5 min
6. hot start PCR
热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。尽管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在 72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行 PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如 site-directed 突变、表达克隆或用于 DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动 PCR 尤为有效。
限制 Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制 PCR 反应液，并将其置于预热的 PCR 仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入 Taq DNA 聚合酶，在反应体系达到 90 度时，PAUSE，将温度保持在 70 度以上，手工加入 polymerase，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。
7. Booster PCR
我们知道 1ug human genomic DNA 大约在 3X105 个模板分子, 这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低, 比如低于 100 个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体. 这样就有来了个 booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个 booster.
具体是这样的. 开始几个 cycles 保持 primer 的低浓度, 保证 primer:template 的 molar ratio 在 10 7～ 10 8. 以确保开始扩增的准确性. 然后 booste Primer 的浓度到正常的水平
8. 循环数和长度
确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数. 因为过多的循环数容易造成 ERRORS 和非特异性产物的积累产物的量不够, 优化的方法有:
1. 增加 TEMPLATE
2. 增加循环数
如何确定循环数, 有一个方法.
做一个 PCR 体系,40 循环,50ul, 分别在 20,25,30,35 循环时从体系中取 5ul, 一起跑电泳分析. 从而确定最佳的循环数
另一个会影响 PCR 特异性的是 PCR cycling 时在两个温度间变化的速率 (ramping rate). 当然是越高越好. 不过咱们大部分条件有限, 就那么几台 PCR 仪, 也没有多少挑选的余地
9. thermal cycler
PCR 仪的因素我们经常容易忽视. 长时间的使用后需要调整 PCR 仪, 以保证其能够到达正确的温度. 现在的 PCR 仪基本上都有自检功能 (self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者说 enhancer 实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA 结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性, 减少错配, 增加产物的长度和产量.
在 GC Rich 情况中, additive 可以造成配对碱基间的的不稳定, 从而提高扩增的效率. 而在另一种情况下,additive 由于造成错配的 primer-template 复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性. 要注意的是, 没有万能的 enhancer 全部通用, 需要你根据自己的情况, 最好结合 gradient pcr 选择最优条件.
dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
要注意的是,DMSO,GLYCEROL 等会抑制 polymerase 的活性, 所以需要 scouting 出最适的浓度
11. Template DNA preparation
提取 DNA 时的试剂会抑制 PCR 反应的顺利进行. 因此需要对 TEMPLATE DNA 进行纯化. 特别是 SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制 PCR 的进行. 可以加入一些 nonionic 试剂, 如 Tween, Nonid, Trition 之类的反过来抑制 SDS. 还有 proteinase K 也要除干净, 不然会降解 polymerase.
12. Nested PCR
简单点说设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板, 这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.
高保真酶
高温 DNA POLYMERASE 是以单链 DNA 或 RNA 为模板，在 dNTP 和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按 3'-5' 方向合成 DNA. 包括 3 种类型
a.5'-3' 方向的 DNA 合成能力, 没有 3'-5' 方向的外切酶特性. 如 Taq 及其突变体. 这类酶的合成能力强, 因为他不纠正合成中出现的突变
b. 与 a 类似, 有合成活性, 没有 3-5 的外切活性. 但他们能以 RNA 为模板, 合成 DNA. 如 Tth DNA Polymerase
c. 有 DNA 聚合活性, 没有逆转录活性, 但有 3-5 方向的外切酶活性. 如 pfu DNA Polymerase. 可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比 Taq DNA 聚合酶低。
酶的混合物
将 Taq DNA 聚合酶同带有 3' 到 5' 外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独 Taq DNA 聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。
其他因素
除了酶，高浓度的 dNTP 或镁离子会降低忠实性。将 dNTP 的浓度从 200μM 降低到 25-50μM 可以增加精确度如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的 PCR 循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。

引物设计简介
1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定 PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的 Tm 值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在 RNA-PCR 中也能识别 cDNA 或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整 Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。一些影响 PCR 反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。因此通过计算机软件选择的引物的总体「质量」（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。
需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或 5' 端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍 PCR 反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。

2．基本 PCR 引物设计参数
引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的 PCR 扩增子，在 EB 染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一 PCR 循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；
特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果 PCR 的退火温度设置在近于引物 Tm 值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18 到 24 个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化 PCR 反应，使用确保溶解温度不低于 54℃ 的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高 4 倍；这样，大多数应用的最短引物长度为 18 个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24 聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。
②引物的二级结构
包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的 3' 末端形成的二聚体，应控制其 ΔG 大于-5.0kcal/mol 或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或 5' 端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以 3' 端或近 3' 端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免 3' 末端有发卡结构的引物。
③引物 GC 含量和 Tm 值
PCR 引物应该保持合理的 GC 含量。含有 50% 的 G+C 的 20 个碱基的寡核苷酸链的 Tm 值大概在 56～62℃ 范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了 Tm 值导致特异性的丧失。这种情况下引物 Tm 值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm 值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种 GC 含量和 Tm 值的协调非常关键。一般来说，一对引物的 Tm 值相差尽量不超过 2～3 摄氏度，同时引物和产物的 Tm 值也不要相差太大，20 摄氏度范围内较好。
④引物的额外序列与退火温度
若有额外的序列信息要加到引物中，例如 T7RNA 聚合酶结合位点、限制酶切位点或者 GC 发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物 5' 端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行 4 到 5 个扩增循环；然后在假定引物 5' 端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。
在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的 5' 端有 2 至 3 个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定 PCR 反应时的退火温度又是必须的。对于低于 20 个碱基的引物，Tm 值可以根据 Tm = 4(G+C)+2(A+T) 计算。而对于较长的引物，Tm 值需要考虑动力学参数、从「最近邻位」的计算方式得到，现有的 PCR 引物设计软件大多数都采用这种方式。
⑤引物的 3' 末端核苷酸组成
引物 3' 末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物 3' 末端最后 5 到 6 个核苷酸的错配应尽可能的少。如果 3' 末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物 3' 末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在 3' 末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的 PCR 产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争 PCR 状态，从而影响扩增成功。
引物 3' 末端的稳定性由引物 3' 末端的碱基组成决定，一般考虑末端 5 个碱基的 ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则 3' 末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。
需要注意的是，引物 3' 末端应尽量避免 T。实验证明，以 T 结尾的引物即使与 T, G 或 C 错配仍可有效延伸。
⑥PCR 产物的长度及在耙序列内的位置
所有的计算机程序都提供对 PCR 产物长度范围的选择。一般说来，PCR 产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR 产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异 DNA 片段的临床检验方法，120～300bp 的小 DNA 扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。
其他 PCR 方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的 RNA-PCR 检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在 250～750bp 范围内。
⑦补充说明
若在 cDNA 序列内找寻 PCR 引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在 mRNA 的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像 3' 末端非编码区域与许多其他 mRNA 有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使 RNA 特异的 PCR 产物与从污染 DNA 中产生的产物在大小上相区别。
若 PCR 的目的是克隆一个基因或 cDNA 的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。
在选择用来扩增来自不同物种 DNA 的引物时，应避开 mRNA 的 5' 和 3' 末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。

3．简并引物设计
①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。
②充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
③应努力避免 3' 末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物 3' 末端不要位于密码子的第三位。
④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

4．测序引物设计
当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：
①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。
②测序引物的 Tm 值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级 DNA 聚合酶来催化，并采用 PCR 的热循环程序。选用的测序引物的 Tm 值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。

5．探针的设计
探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论：
①探针的长短一般在 20-50 核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。
②注意 G 和 C 的含量努力控制在 40-60%，同时一种碱基连续重复不超过 4 个，以免非特异性杂交产生。
③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有「发夹」结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。
④如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在 70% 以下。
PCR 中常见问题分析与对策．
PCR 产物的电泳检测时间
一般认为 PCR 产物应在 48 h 以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于 48 h 后带型就会出现不规则，甚至消失。

Trouble shooting guide
1．假阴性，不出现扩增条带
PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时 PCR 时忘了加 Taq 酶或电泳时忘了加溴化乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20μl、30μl、50μl 或 100μl，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20μl 后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。
物理原因：温度对 PCR 扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 PCR 仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。
2．假阳性
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。
3．出现非特异性扩增带
PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策）有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法 (93℃ 变性，65℃ 左右退火与延伸，也叫两步法)。
4．出现片状拖带或涂抹带
PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶的量，或调换另一来源的酶。②减少 dNTP 的浓度。③适当降低 Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。

我们长期为科研用户提供前沿资讯、实验方法、选品推荐等服务，并且组建了 70 多个不同领域的专业交流群，覆盖 PCR、细胞实验、蛋白研究、神经科学、肿瘤免疫、基因编辑、外泌体、类器官等领域，定期分享实验干货、文献解读等活动。

添加实验菌企微，回复【】中的序号，即可领取对应的资料包哦～

【2401】论文写作干货资料（100 页）

【2402】国内重点实验室分子生物学实验方法汇总（60 页）

【2403】2024 最新最全影响因子（20000+ 期刊目录）

【2404】免疫学信号通路手册

【2405】PCR 实验 protocol 汇总

【2406】免疫荧光实验 protocol 合集

【2407】细胞培养手册

【2408】蛋白纯化实验手册