转录因子
（
TFs
）
的精确定位与功能解析是理解细胞命运决策、发育过程及疾病机制的关键。传统的转录因子结合检测方法存在一定的局限性，难以同时满足高分辨率、高通量和可扩展性的需求。2024年12月17日，昌平实验室/北京大学生物医学前沿创新中心
谢晓亮
课题组在
PNAS
上发表题为
Genome-wide single-cell and single-molecule footprinting of transcription factors with deaminase
的研究论文，
报道了一种基于脱氨酶的单分子印迹新技术，称为FOODIE
（FOOtprinting with DeamInasE）
。
FOODIE方法的优势在于其兼容广泛使用的二代测序平台，具有更低的成本、更高的扩展性，并能够在单分子和单细胞层面进行分析，显著提高了检测转录因子结合的通量和分辨率。
2025年1月29日，加州大学圣地亚哥分校的
常蕾
博士与
任兵
教授在
PNAS
发表了题为
Efficient, scalable, and near- nucleotide- resolution profiling of protein occupancy in the genome with deaminases
的关于FOODIE技术的评论文章，该文章
系统回顾了转录因子印记技术的发展，通俗易懂地介绍了FOODIE的技术原理，高度评价了这一项变革性（transformative）技术在分辨率、灵敏度和应用前景等方面的显著优势。
转录因子
（TFs）
通过与特定的DNA序列
（顺式调控元件）
结合，通常与其他DNA结合蛋白和辅因子协同作用，建立每个细胞中的转录程序，从而决定细胞的身份、功能和适应性
【1】
。了解转录因子与DNA相互作用在基因组中的位置非常重要，因为转录因子结合的异常与发育障碍、癌症以及糖尿病和神经退行性疾病等复杂疾病有关。在近期PNAS中，
谢晓亮课题组开发了一种名为FOODIE的创新方法，能够在单细胞水平上实现全基因组范围内接近单碱基分辨率的转录因子印记分析。这一工具极大地增强了我们在组织样品的不同细胞类型中解析基因调控网络的能力。
在组织中分析转录因子印记具有挑战性，原因如下：首先，转录因子占据具有动态性，因细胞类型、发育阶段和环境条件而异，因此需要在单细胞分辨率下对组织中的转录因子印记进行分析。其次，转录因子识别的序列相对较短，因此仅凭识别序列的存在并不能准确预测实际结合，需要实验测量。第三，转录因子的功能通常依赖于与其他因子的协同作用，这进一步复杂化了其结合模式，增加了预测难度和实验检测的必要性。最后，基因组编码数千种转录因子，而现有方法缺乏在不同细胞群体中系统绘制其印记所需的可扩展性、分辨率和通量。
传统的转录因子结合定位方法
（图1）
，如染色质免疫沉淀测序
（ChIP-seq）
【2，3】
、ChIP-exo
【4】
或CUT&RUN
【5】
，依赖于质量参差不齐且种类有限的抗体，限制了其普适性。此外，此外，转录因子结合的序列对核酸酶切割或转座子插入具有空间排斥性。基于这一原理，DNase-seq
【6】
和ATAC-seq
【7】
也成功用于绘制转录因子足迹
【8-10】
。然而，这些方法通常需要大量细胞和深度DNA测序，限制了其在批量样本中的应用，且难以解析转录因子间的协同作用。
单分子转录因子印记
（SMF）
检测技术利用外源性DNA修饰酶来检测单个DNA分子上的转录因子足迹
【11】
。SMF可以同时鉴定转录因子结合和未结合的DNA序列，具有确定转录因子在细胞群体中与DNA结合频率的优势。迄今为止，已报道了三类SMF方法，具体如下
（图1）
。
图1. (A) 转录因子（TF）足迹分析的四种方法示意图。(B) 各种转录因子足迹分析方法的比较，涉及基因组分辨率、细胞分辨率以及与不同类型测序平台的兼容性。NGS，下一代测序平台；TGS，第三代测序平台。
第一类方法利用胞嘧啶甲基转移酶对暴露的DNA序列上的胞嘧啶进行甲基化。其中一种酶M.CviPI可以在GpC上甲基化胞嘧啶。转录因子与DNA的结合会阻碍结合位点内的胞嘧啶被甲基化，使其在亚硫酸氢盐转化后检测为
（PCR后）
胸腺嘧啶，而结合位点外的胞嘧啶则检测为胞嘧啶
【12, 13】
。当与第三代单分子长读长DNA测序技术结合时，这种方法可以实现多个转录因子在相邻DNA上结合的识别
【14】
。然而，该方法的分辨率受到转录因子结合位点内GpC位点分布不均以及内源性胞嘧啶甲基化的限制。
第二类SMF方法利用N6腺嘌呤甲基转移酶对暴露的腺嘌呤进行甲基化，生成可通过第三代测序检测的DNA m6A修饰。诸如Fiber-seq
【15】
、SAMOSA
【16】
和DiMeLo-seq
【17】
等方法利用这一策略绘制了细胞中DNA上的转录因子足迹。由于腺嘌呤在基因组中含量丰富，这些方法实现了接近单碱基的分辨率。然而，三代测序的高成本和m6A修饰检测可靠性的挑战限制了这些方法的广泛应用。
在近期PNAS上，谢晓亮团队发表了第三类SMF方法，该方法利用胞嘧啶脱氨酶将胞嘧啶转化为尿嘧啶，后在PCR和二代测序后检测为胸腺嘧啶。转录因子结合位点内的胞嘧啶保持未转化状态，从而实现了接近核苷酸分辨率的足迹检测
（图1A）
。此外，由于该方法与广泛使用的二代测序平台兼容，使其具有低成本、高可扩展性以及适用于单细胞分析的潜力
（图1B）
。
为了找到适合SMF的高活性胞嘧啶DNA脱氨酶，谢晓亮团队筛选了多种细菌酶，并鉴定出两种候选酶——DddB和MGYPDa829——它们均表现出必要的酶活性和均匀的序列覆盖度。然而，MGYPDa829倾向于逐步将胞嘧啶转化为尿嘧啶，这影响了相邻位点上协同结合的转录因子的检测。因此，DddB被选为FOODIE的开发基础。由于转录因子通常结合于开放的染色质区域，作者进一步将FOODIE与基于Tn5转座酶的片段化技术结合，以从细胞中富集这些开放区域进行转录因子足迹分析。这一简化的实验方案稳定、易于实施，且适用于相对较少的细胞数量，并可扩展到单细胞分析。
FOODIE能够准确检测人淋巴母细胞系GM12878中的转录因子足迹，并在灵敏度和分辨率上较以往的转录因子足迹分析方法有显著提升。基于现有的ChIP-seq数据，可将该细胞类型中的足迹分配给79种已知的转录因子，并进一步绘制转录因子结合印记在启动子和增强子中的分布模式。作者还开发了单细胞FOODIE
（scFOODIE）
，以在异质的细胞群体中实现细胞类型特异性的转录因子足迹分析。作为原理验证，作者展示了scFOODIE能够在四种人类细胞系
（GM12878、K562、HEK293和HeLa）
的混合样品中解析各种细胞的转录因子结合模式，其中细胞类型特异的开放染色质信号可用于细胞分类。随后，他们将scFOODIE应用于小鼠海马体，成功分析了来自八种主要脑细胞类型的11,200个细胞中的转录因子足迹。
FOODIE分析揭示了转录因子如何协调同时表达的基因
（称为相关基因模块，CGMs）
的转录
【19】
。研究结果表明，调控基本细胞功能的基因依赖于启动子上的转录因子结合以实现表达的稳定性，而特异性表达的基因则更多地依赖于增强子上的转录因子结合，以实现更高的可调性。作者还利用FOODIE研究了DNA上的成对转录因子结合模式，这些模式可以是正相关
（协同性）
或负相关
（排他性）
【20】
。作者设计了一种算法，从FOODIE数据中量化转录因子的协同性，并发现更多的转录因子表现出正协同性而非排他性。转录因子之间的正协同性支持多因子的浓度依赖性DNA结合，而负协同性则确保当细胞核中转录因子浓度突然变化时，基因调控能够快速响应。FOODIE检测转录因子之间正负协同性的能力将极大地提高研究者对复杂基因调控网络的理解。
与此同时，Andrew B. Stergachis团队在一篇预印本中描述了一种类似的基于脱氨酶的SMF方法，名为DAF-seq
【21】
。与FOODIE不同，该方法在第三代测序平台上以接近单核苷酸的分辨率绘制特定基因组位点的转录因子足迹。
与其他检测转录因子足迹的方法相比，FOODIE具有几个关键优势：它易于操作实施，适用于高通量工作流程，且成本低。此外，它可以扩展到单细胞分辨率，从而在异质组织中检测不同的细胞类型，并评估每个细胞群体中的全基因组转录因子足迹。通过在多种组织中应用这一方法，将有可能揭示转录因子结合的协同和基因模块的调控，最终深化我们对转录调控如何驱动发育、塑造物种进化以及导致人类疾病的理解。
总之，
FOODIE代表了一种变革性的转录因子足迹描绘方法，可能极大地加速我们对多细胞生物中基因调控程序的理解。
此外，通过在临床样本中分析转录因子足迹，将有助于识别疾病特异的调控特征。然而，FOODIE目前尚不能解析基因组中所有转录因子的印记，因为许多转录因子的特异性DNA结合序列并不清楚，且许多转录因子共享相似的DNA结合序列。将FOODIE与其他转录因子特异性的分析方法
（如ChIP-seq、CUT&RUN或CUT&Tag）
结合，将解决这一局限性，并带来对基因调控网络更全面的理解。
原文链接：
www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2423270121
www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2425203122
制版人：十一
1. S. A. Lambert et al., The human transcription factors.
Cell
172, 650–665 (2018).
2. G. Robertson et al., Genome- wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.
Nat. Methods
4, 651–657 (2007).
3. D. S. Johnson, A. Mortazavi, R. M. Myers, B. Wold, Genome- wide mapping of in vivo protein- DNA interactions.
Science
316, 1497–1502 (2007).
4. H. S. Rhee, B. F. Pugh, Comprehensive genome- wide protein- DNA interactions detected at single- nucleotide resolution.
Cell
147, 1408–1419 (2011).
5. P. J. Skene, S. Henikoff, An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.
Elife
6, e21856 (2017).
6. J. R. Hesselberth et al., Global mapping of protein- DNA interactions in vivo by digital genomic footprinting.
Nat. Methods
6, 283–289 (2009).
7. J. D. Buenrostro, P. G. Giresi, L. C. Zaba, H. Y. Chang, W. J. Greenleaf, Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA- binding proteins and nucleosome position.
Nat. Methods
10, 1213–1218 (2013).
8. Z. Li et al., Identification of transcription factor binding sites using ATAC- seq.
Genome Biol.
20, 45 (2019).
9. M. Bentsen et al., ATAC- seq footprinting unravels kinetics of transcription factor binding during zygotic genome activation.
Nat. Commun.
11, 4267 (2020).
10. Y. Hu et al., Single- cell multi- scale footprinting reveals the modular organization of DNA regulatory elements.
bioRxiv
[Preprint] (2023). https://doi.org/10.1101/2023.03.28.533945 (Accessed 7 December 2024).
11. A. R. Krebs, Studying transcription factor function in the genome at molecular resolution.
Trends Genet.
37, 798–806 (2021).
12. C. Sönmezer et al., Molecular co- occupancy identifies transcription factor binding cooperativity in vivo.
Mol. Cell
81, 255–267.e6 (2021).
13. F. D. Lay, T. K. Kelly, P. A. Jones, “Nucleosome occupancy and methylome sequencing (NOMe- seq)” in DNA Methylation Protocols,
J. Tost, Ed.
(Springer New York, New York, NY, 2018), pp. 267–284.
14. S. Battaglia et al., Long- range phasing of dynamic, tissue- specific and allele- specific regulatory elements.
Nat. Genet.
54, 1504–1513 (2022).
15. A. B. Stergachis, B. M. Debo, E. Haugen, L. S. Churchman, J. A. Stamatoyannopoulos, Single- molecule regulatory architectures captured by chromatin fiber sequencing.
Science
368, 1449–1454 (2020).
16. N. J. Abdulhay et al., Massively multiplex single- molecule oligonucleosome footprinting.
Elife
9, e59404 (2020).
17. N. Altemose et al., DiMeLo- seq: A long- read, single- molecule method for mapping protein–DNA interactions genome wide.
Nat. Methods
19, 711–723 (2022).
18. R. He et al., Genome- wide single- cell and single- molecule footprinting of transcription factors with deaminase.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
. 121, e2423270121 (2024).
19. A. Dixit et al., Perturb- Seq: Dissecting molecular circuits with scalable single- cell RNA profiling of pooled genetic screens.
Cell
167, 1853–1866.e17 (2016).
20. A. Jolma et al., DNA- dependent formation of transcription factor pairs alters their binding specificity.
Nature
527, 384–388 (2015).
21. E. G. Swanson et al., Deaminase- assisted single- molecule and single- cell chromatin fiber sequencing.
bioRxiv
[Preprint] (2024). https://doi.org/10.1101/2024.11.06.622310 (Accessed 7 December 2024).
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（*排名不分先后）
