巨噬细胞在微环境中，其实起到了非常重要的作用，而研究巨噬细胞在微环境中的细胞间Crosstalk也算是比较热门的课题方向。今天讲的这篇就是北京大学发表在13.6分的Protein Cell上的文章，这篇文章还是挺有意思的，通过巨噬细胞对于心肌梗死后的心脏成纤维细胞的影响，分析了成纤维细胞的重编程。这篇文章中，他们首先就提出了一个有意思的假设，假设IFNR，也就是干扰素受体，在心脏成纤维细胞重编程的过程中起到的作用（假设是一篇文章或者一个课题开展的重要开端，通过假设和假设的迭代，才能更好地推进课题，不清楚科研假设应该如何提出，和提出假设的规则的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》），从而解开了整个巨噬细胞与心脏成纤维细胞之间的互作关系。我们就来看看他们是怎么做的吧：
心肌梗死过程中，受损的位置会形成成纤维细胞，也就是形成疤痕。而成纤维细胞如果通过重编程，是可以变成iCM（诱导的心肌细胞）的，这个过程需要过表达GMT（GATA4，MEF2C和TBX5）。于是他们通过构建Tet质粒，使用MICF（从患有心肌梗死的成年小鼠中分离的心脏成纤维细胞）做了一个体外诱导iCM的实验，而为了分析IFNR对于iCM诱导的影响，又对两个IFNR进行了敲减（这就是柯霍氏法则的验证，通过移除潜在的关键因素后，查看表型，来分析该关键因素对于表型的贡献，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。通过体外验证后发现，敲减了IFNR后，会促进心脏成纤维细胞分化为心肌细胞：
那么在体外实验有这样的现象，换到体内的话，是否能重复呢？但体内实验其实比较难做，于是他们就进行了一点点设计。首先是用慢病毒感染，来进行特异性地过表达和敲减，而要保证两者的同步，他们就设计了这样的Tet on质粒（Tet on和Tet off这个技术其实比较成熟了，就是通过rtTA与多西环素的结合，启动或抑制转录的过程，这个在《列文虎克读文献》里介绍过，可以回去看看）。敲减的shRNA质粒上，同时会过表达rtTA，而rtTA表达后，加入DOX（多西环素）可以激活对于MGT的诱导表达。通过这样的组合慢病毒质粒设计，可以达到敲减和过表达的同步，在感染慢病毒后，他们又通过加入TMM（他克莫司）来降低小鼠免疫力，从而增强感染效率。通过体内实验，也验证了敲减IFNR对于心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的促进作用：
而体内实验也表明，在心肌梗死小鼠模型中，过表达MGT，同时敲减IFNR，可以增强心脏成纤维细胞重编程转换为心肌细胞，改善小鼠心肌梗死后的心脏功能：
那么问题就来了，既然IFNR这么重要，那激活IFNR这样的受体，就需要存在配体（IFN可以激活的信号通路就有很多，比如JAK-STAT信号通路等，而配体和膜受体的结合就是激活信号通路的关键 ，不清楚信号通路的传导的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）。这个配体就是IFNβ，那么问题就又来了，在心肌梗死发生后，心脏微环境中，什么细胞才会分泌IFNβ呢？通过测序分析，他们发现，心肌梗死微环境中IFNβ高表达的细胞里，有八成多是巨噬细胞。也就是说很可能是由于心肌梗死后，巨噬细胞的浸润，造成了IFNβ分泌的增多。为了验证巨噬细胞的功能，他们在心肌梗死模型中，使用了CL2MDP（巨噬细胞清除剂）。清除巨噬细胞后，大大缓解了心脏成纤维细胞的重编程，也就是说巨噬细胞分泌的IFNβ很可能就是阻碍心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞的关键：
IFNβ通过激活IFNR后，会激活JAK-STAT信号通路，而JAK-STAT信号通路中STAT在被磷酸化后，会形成二聚体（这个要回去复习一下《信号通路是什么鬼？》系列中的JAK-STAT信号通路了，这个信号通路已经算是比较常见而又简单的信号通路了）。同时STAT1在磷酸化后，也会结合GMT中的GATA4，通过BiFC（双分子荧光互补）实验，他们确定了这俩分子之间的结合。而STAT1与GATA4结合后，会导致GATA4无法结合到启动子上，从而抑制了GMT激活的心脏成纤维细胞重编程相关基因的转录：
另一方面，JAK-STAT信号通路激活后，他们发现心脏成纤维细胞中STAT1会激活CCl2、CCl7、CCL12等趋化因子的转录。为了证明STAT1激活后，对于CCl2、CCl7、CCL12等趋化因子的转录，他们对这些趋化因子的启动子进行了突变，突变后IFNβ对于趋化因子的诱导转录明显被抑制了，这也就是说明STAT1参与了IFNβ对于趋化因子的诱导（这里值得肯定的是，他们使用了启动子位点的突变来进行验证，这样做可以有效避免肯定后件的逻辑谬误，使得验证更为严谨，不清楚肯定后件的逻辑谬误，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。这些趋化因子又是能诱导巨噬细胞迁移的，也就是说IFNβ激活的STAT1磷酸化，从另一方面形成了一个正反馈诱导巨噬细胞浸润的闭环。一方面巨噬细胞通过IFNβ抑制成纤维细胞重编程成为心肌细胞，另一方面IFNβ激活趋化因子，诱导更多巨噬细胞浸润到损伤的心肌部位：
最后就形成了这样的示意图，心肌梗死发生后，产生的成纤维细胞，收到了巨噬细胞分泌的IFNβ激活，通过JAK-STAT信号通路，激活的STAT1在磷酸化后，一方面抑制GATA4的转录，从而抑制心脏成纤维细胞重编程；另一方面通过激活CCl2、CCl7、CCL12等趋化因子的转录，诱导巨噬细胞浸润，形成一个正反馈途径。而抑制IFNR后，STAT1的磷酸化无法被激活，趋化因子转录降低，而GMT下游的心脏成纤维细胞重编程相关基因转录激活，导致心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞，缓解了心肌梗死后的心脏功能：
这篇文章还是挺有意思的，通过一系列的验证，确定了巨噬细胞与心脏成纤维细胞之间的一个正反馈通路。而在各个验证环节中，也做到了相对严谨，算是一篇不错的文章。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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