有博士生竟然问啥是逻辑严谨！那给他看这哈尔滨医科大学的14.3分SCI文章，这线粒体PAR死亡的验证就很丝滑……

今天这篇文章挺有意思，做得也是不错，这篇文章讲的是线粒体PARthanatos，这个是一种细胞的新死法。这篇文章是哈尔滨医科大学附属第二医院博士生，发表在14.3分的Adv Sci（Weinh）上的 。这篇文章有意思的点就在于最后的机制验证，他们的机制研究并不算特别深入，但是机制的验证确实深得我心的（ 因为他们的验证过程中，将研究的范围缩小在了NFS1基因结合H2S的点上，缩小了概念的外延，也就意味着这篇文章的验证过程是十分经得起推敲的，也能避免肯定后件的逻辑谬误，不清楚科研推理，概念外延和内涵的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列 ）。我们就一起来看看他们都做了点什么吧：

他们研究的是DCM（糖尿病性心肌病），也就是在T2DM（2型糖尿病）患者中心脏损伤。首先他们构建了db/+的糖尿病杂合小鼠（作为对照）以及db/db的糖尿病纯合小鼠，来分析模型小鼠的心脏病变变化，同时通过转录组测序来分析db/db纯合小鼠中基因表达的差异（ 这个过程，其实就是归纳法的米勒五法中的求同求异法，通过两个不同分组，分析组内趋同的组间差异，通过这样的分析，找出DEG，也就是差异基因，将这些差异基因与DCM联系起来，不清楚归纳法或者米勒五法的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》 ）。通过对这些DEG的聚类，他们发现DCM小鼠中，Fe-S簇（铁硫簇）合成相关的基因及线粒体呼吸功能相关的基因表达负相关，也就是说在DCM小鼠中，Fe-S簇合成被破坏，线粒体呼吸功能产生了障碍。其中NSF1是Fe-S簇合成的关键基因，在DCM小鼠中表达下降：

为了确定NSF1的功能，他们敲减了正常小鼠心肌细胞中的NSF1，然后查看下游的基因表达变化（ 这个过程其实就是柯霍氏法则的验证，通过移除某个关键基因，来查看该基因的表达对于表型造成的影响，在这里他们敲除了NSF1，来查看下游潜在表达基因的变化，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》 ）。他们发现NSF1敲减后，Fe-S簇合成被破坏，与DCM的发展以及线粒体和DNA损伤之间存在潜在联系。

Fe-S簇的损伤，导致了线粒体和DNA损伤，同时促进了细胞的死亡。PARthanatos这种死亡就和DNA损伤以及线粒体损伤密切相关，核DNA的氧化损伤，会导致PARP1通过催化PAR（聚ADP-核糖）的产生，来募集其他修复酶。而度的PARP1表达和激活，会导致PAR积累，诱导AIF（线粒体凋亡诱导因子）易位到细胞核，并导致DNA片段化介导的细胞死亡，这个过程就是PARthanatos。于是他们提出了一个假设，假设Fe-S簇的损伤会通过PARthanatos这种死亡方式，诱导细胞死亡（ 假设的迭代就是这样，通过对之前研究的结果进行总结，而在总结后提出一个新的可能性，这个新的可能性就是假设的迭代，假设迭代是一篇文章能够推进并且得到新的结果的关键，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》 ）。要怎么验证PARthanatos确实发生了呢？他们首先要看敲减了NSF1后，是否会导致PARP1表达的抑制，其次就是看AIF的定位是否从线粒体转移到了细胞核。NFS1是一种半胱氨酸脱硫酶，它会从半胱氨酸中提取硫，为Fe-S簇合成提供了必需的硫源。于是他们假设，如果补充S的来源，如H2S，是否能缓解敲减了NSF1后造成的心肌损伤。结果显示通过GYY或NaHS来补充H2S，可以有效增强db/ab小鼠的心脏功能并增加Fe-s蛋白水平：

那对于补充H2S，能缓解敲减了NSF1后造成的心肌损伤，那么造成这种缓解的关键，是否是通过抑制PARthanatos造成的呢？他们通过分析补充H2S后的PARP1的激活活性，以及AIF的入核情况，并且分析了线粒体有氧呼吸的情况（ 下图中的SeaHorse实验结果中的OCR图，耗氧率图，就是展示了氧化呼吸情况，这个图在《信号通路是什么鬼？》系列的铜死亡中，也介绍过，和ECAR，细胞外酸化率差不多，都是为了分析线粒体有氧或无氧呼吸的，不清楚的话可以回去翻翻相关的那几个章节 ）。而在这个过程中，是否需要NSF1从半胱氨酸中获取硫呢？为了验证这个，他们进行了半胱氨酸缺陷型培养基的验证，结果发现补充H2S，并不需要通过NSF1从半胱氨酸中获取硫，而是一个独立的产生铁硫簇的途径：

那么问题又来了，H2S是如何将S转移给NSF1的呢？通过质谱分析，他们发现NSF1的C383残基是结合H2S上硫的关键位点。那么接下去的验证，都要围绕着NSF1的C383来进行了（ 这就是将验证的节点缩小到了“NSF1的C383位点与硫结合”，而不再是“NSF1的表达”这个外延更大的概念上，通过缩小概念的外延，可以更精准地进行验证，并且避免中项不周延或者肯定后件的逻辑谬误，不清楚逻辑谬误或者概念的外延和内涵的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列 ）。他们通过对NSF1的C383残基进行突变，来分析加入H2S后，对于下游表型的影响。结果确定H2S促进NFS1-S硫酸化，并影响线粒体PARthanatos，都依赖于NFS1的半胱氨酸383残基：

最后就差不多是这么一个示意图（ 当然这个是夏老师用PPT随便画的，不清楚要怎么画的话，回去看看《夏老师带你读文献》复习下，里面都介绍过了 ），也就是糖尿病造成的高糖高脂会抑制NSF1表达，而NSF1是促进铁硫簇形成的关键，铁硫簇产生会促进有氧呼吸，抑制ROS产生。一旦ROS产生，会导致DNA损伤，从而激活PARP1，当PARP1产生了过量的PAR后，则会使得AIF从线粒体上转移至细胞核内，导致心肌细胞发生PARthanatos。而H2S可以通过NSF1的C383残基，促进铁硫簇形成，从而抑制ROS产生，避免心肌细胞发生PARthanatos：

这篇文章的验证的内容虽然并不算很多，但相对绝大多数文章来说，这篇文章的验证是比较细致的。验证的过程中，他们通过敲除NSF1后，表达C383残基突变的NSF1，来查看表型，其实也是一种柯霍氏法则的验证，算是挺有意思的。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。

（ 本文为夏老师个人观点，仅讨论文章本身，对超出文章以外的内容并不多做评价，如有异意，欢迎在评论区讨论 ）

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