大家好，今天给大家分享一篇近期发表在
Journal of the American Chemical Society
上的文章，题为：
Extreme pH Tolerance in Peptide Coacervates Mediated by Multivalent Hydrogen Bonds for Enzyme-Triggered Oral Drug
。
该文章的通讯作者为清华大学的俞璟教授和高华健教授。
生物大分子基
凝聚体
具有多功能性和良好的生物相容性，在药物递送领域具有广阔的应用前景。然而，它们在极端
pH
和高盐浓度下的低稳定性限制了其在药物
口服
递送中的实际应用。
比如
在胃液的低
pH
环境中，带负电荷的生物大分子可能因质子化失去电荷，导致
凝聚体
解离。同样，高
pH
和高盐浓度
下的屏蔽作用
也会使
凝聚体
不稳定。此外，
目前
对于生物大分子基
凝聚体
的形成和稳定
的
分子机制理解不足，
也
阻碍了其发展。
贻贝足蛋白
5 (Mfp-5)
在分泌过程中会在酸性环境中发生相分离，受此启发，本文作者设计了两种短肽多巴
-GG23
*
和
GK16
，如图
1
所示。形成的凝聚体在
1
至
11
的
pH
范围内及不同盐浓度下均能保持稳定。多价氢键和静电相互作用的协同效应是调控该肽凝聚体形成和稳定的主要因素。此外，
GG23*-GK16
凝聚体在酸性环境中能高效封装各类小分子和大分子，并且在特定酶的作用下释放货物，这使其有望成为药物口服递送平台。
图
1.
受天然蛋白启发、有高稳定性的
GG23*-GK16
凝聚体
Mfp-5
主要包括两种基序，一种富含带正电的氨基酸，另一种富含带负电的氨基酸。作者首先根据
Mfp-5
的序列设计了带负电荷的
GG23
*
(GY*DGY*SDGY*Y*DG Y*DGY*SDGY*Y*DG
，
Y*
代表多巴
)
和带正电荷的
GK16 (GYKGKYYGKGYKKYYYK
，
Y
代表酪氨酸
)
两个短肽，在
pH = 7.4
、
500 mM NaCl
的类海水的条件下形成凝聚体。与未修饰的
GG23-GK16
相比，
多巴修饰
能引入
多价氢键、
π−
π
堆叠和
cation-π
相互作用
等多种非共价相互作用，增强凝聚体的稳定性，影响其性能，其中作者认为多价氢键发挥了重要的作用。具体来说，多巴修饰提高了凝聚体的耐盐性，降低形成凝聚体的临界肽浓度，扩大有凝聚倾向的
GG23*/GK16
摩尔比范围
,
甚至能够偏离电荷中和条件。相同条件下，形成的
GG23*-GK16
凝聚体更多，有效界面能类似于凝胶。如图
2
所示。
图
2.
凝聚体
GG23*-GK16
与
GG23-GK16
稳定性比较
接下来作者又证明了多巴引入的多价氢键在
GG23*-GK16
凝聚体的
宽
pH
范围稳定性
中的重要作用。与常用的凝聚体体系
PAA-PEI
、
HA-PDDA
、
PRE−PLK
相比，
GG23*-GK16
在
pH
=
1
到
pH
=
11
的条件下均能保持稳定
。
Zeta
电位结果表明，即使在
GG23
中的
Asp
残基
发生质子化破坏静电相互作用后，多巴介导的氢键依旧能维持凝聚体稳定性。加入尿素破坏氢键，相分离区域显著减少，证明了氢键在凝聚体形成中的关键作用。
FRAP
表明多巴显著降低了凝聚体的流体性，多巴改性的
GG23*-GK16
凝聚体表现出更接近凝胶的性质，加入尿素后流动性又恢复。综上所述，作者认为多价氢键可以使凝聚体中的肽链结合更紧密，减少肽的扩散。如图
3
所示。
图
3.
多价氢键使
GG23*-GK16
凝聚体具有宽
pH
范围稳定性
作者进一步用
MD
模拟分析
GG23*-GK16
凝聚体形成背后的分子机制。在
1
μs
的模拟时间内，带有相反电荷的肽段形成二聚体，并迅速聚集。在
GG23*-GK16
系统中，聚集体的尺寸迅速且持续增加，接近理论最大值，并保持稳定；而在
GG23-GK16
系统中，最大的聚集体尺寸增加到约理论最大值一半后波动，没有进一步聚集的趋势，表明多巴修饰的
GG23*
更倾向于与
GK16
形成复杂的凝聚体。作者又发现与
GG23
相比，
GG23
*
肽之间的氢键数目显著增加，证实了多巴介导的多价氢键在二聚体结合形成凝聚体中的关键作用。
此外，
GG23
*
中
Y*
富集区域的残基
5−10
之间的接触显著增加，
与多巴
修饰形成的多价氢键一致。在模拟中还观察到了
π−π
相互作用
和
cation-π
相互作用
，也参与
促进了
凝聚
体的形成和稳定。
如图
4
所示。
图
4.
MD
模拟凝聚体形成的相关分子机制
接下来，作者将
GK16
中的
Lys
和
Tyr
突变为其他氨基酸以研究多种非共价相互作用在凝聚体形成中的作用。结合实验结果与
MD
模拟结果，可以得出
静电相互作用
在凝聚体的形成
中
起
关键作用
。除了多价氢键外，
T
yr
介导的
π−π
堆叠
和
cation−π
相互作用
也
是
凝聚体形成
的重要因素。
如图
5
所示。
图
5.
GK16
中氨基酸突变导致的
GG23*-GK16
相分离行为
GG23*-GK16
凝聚体在低
pH
值下的稳定性使其有望作为药物口服递送载体。作者发现
GG23*-GK16
可以有效包封小分子药物、蛋白质及核酸，且具有良好的生物相容性。除了有效包封外，
GG23*-GK16
还可以在胃液中保持稳定，胰蛋白酶触发下在模拟肠液中降解，释放所包封的药物。因此
GG23*-GK16
可以用于在胃中容易降解或代谢的药物的口服递送，保证更多的活性成分到达小肠并被小肠吸收，从而提高生物利用度和治疗效果。
图
6.
GG23*-GK16
作为药物口服递送平台的潜力
综上所述，作者开发了可以在极端
pH
值和高盐浓度下保持稳定的
GG23*-GK16
凝聚体，并与
MD
模拟结合阐明凝聚体的形成过程。此外，
GG23*-GK16
凝聚体可以有效包封各种货物，并在模拟肠液中选择性释放，在药物口服递送方面具有很大的应用前景。
作者：
YXM
DOI
:
10.1021/jacs.4c17880
Link:
https://doi.org/
10.1021/jacs.4c17880
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