动物行为与电生理专题丨啮齿动物睡眠剥夺中的脑电和肌电记录

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睡眠剥夺小鼠模型的建立

根据睡眠缺失的情况，一般将睡眠剥夺分为完全睡眠剥夺（ TSD ）和选择性睡眠剥夺（ SSD ）。既往研究中 TSD 一般指至少 24h 完全睡眠缺失， SSD 指睡眠时相的剥夺如 REM-SD 或 NREM-SD 。与二者相比，日常生活中人类睡眠剥夺大多介于二者之间，尤其是住院患者、慢性疼痛及失眠人群中经常出现睡眠少于 6hTSD 。因此，为了最大限度的模拟临床手术患者睡眠剥夺模式， 可 选择 TSD 剥夺模式。对于睡眠剥夺方法，以往多采用改良的多平台法制作大鼠睡眠剥夺，此方法主要用于 REM 睡眠剥夺，对 NREM 干扰有限，而且由于掉落水中会对动物产生应激影响实验结果。

参考最新 TSD 相关研究，在饲养小鼠的圆形鼠笼底部安装可旋转的机械装置，其中有一根缓慢旋转的棒产生轻柔、持续的机械刺激避免小鼠睡觉。此装置去除了以往装置中小鼠持续的强迫运动，减少了应激干扰。睡眠剥夺前将小鼠放入仪器中熟悉环境 24h ，睡眠剥夺期间小鼠自由饮食，剥夺后在仪器中自由睡眠饮食，减少更换饲养环境的干扰。根据文献资料设定剥夺时间为 3 天，每天 9h （ AM7:00-PM4:00 ）。第三天结束后进行行为学测试及相关实验。为了保证此种睡眠剥夺方法的效果，首先通过给小鼠头部置入脑电图（ EEG ） / 肌电图（ EMG ）监测睡眠情况，确定睡眠剥夺模型构建成功。

- Fig1 睡眠剥夺流程示意图 -

小鼠脑电图（EEG）/肌电图（EMG）置入手术

为记录脑电图（ EEG ） / 肌电图（ EMG ），首先用电路板及银丝焊接自制电极，双通道脑电与双通道肌电。使用 3vol% 异氟醚诱导小鼠麻醉，将小鼠固定在脑立体定位仪上。在手术过程中维持吸入浓度在 1.2-1.5vol% ，剃除小鼠头颈部毛发，碘伏消毒手术部位。用眼科剪从头部开始做一个 1.0 厘米长的椭圆形切口（前至双眼连线，后至颈部上缘），钝性分离皮下组织，用棉签浸润无菌生理盐水剥离颅骨上粘膜及骨膜充分暴露颅骨。用颅骨钻打孔，注意要钻通颅骨，避免损伤硬脑膜，以免影响 EEG 记录质量。使用 3 颗不锈钢螺钉（ 1×3mm ）作为 EEG 电极，并植入颅骨表面（坐标）：正极（ AP:-1.0mm ， ML:-1.5mm ），负极（ AP:-2.0mm,ML:1.5mm ）和参考电极（ AP:-4.0mm,ML:-1.5mm ），植入深度约 0.5mm 。将不锈钢螺丝钉拧转、固定在上述钻好的颅骨孔中，深度以螺丝钉正好越过颅骨为易（螺丝纹 2-3 圈），出血时可用棉签压迫或生理盐水冲洗。将两条银丝电极埋植于颈部两侧的斜方肌内。用牙科水泥将螺丝钉固定于颅骨表面（注意不要将导电的银丝覆盖）。待牙科水泥固定后，用电烙铁将对应的银丝焊接至自制的电路板，再次用牙科水泥将电路板固定于头部。待完全固定后停止麻醉，小鼠苏醒后放置鼠笼单独饲养，术后恢复一周用于实验。

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脑电（EEG）/肌电（EMG）图记录及分析

将置入脑电（ EEG ） / 肌电（ EMG ）的小鼠放入睡眠剥夺仪中，经过万向轮传至前置放大器，经放大后传至 Power Lab 生理记录仪系统采集脑电信号，设置采样频率为 128Hz 。信号滤波设置为： EEG ， 0.5—50Hz ； EMG ， 30—300Hz 。使用 Sirenia Sleep Pro 软件对脑电信号进行分析，所有脑电波均以 10s 为一个 epoch 。 NREM 脑电图为低频（ 0.5-4hz 范围），高振幅（ +/-150-250mv ） delta 波，低振幅 EMG 波。 REM 脑电波以 θ 波为主（ 6-9hz 范围）、低振幅（ +/-50-100mV ）和平坦的混合频率肌电图。 Wake 期脑电图为高频（ 8~50Hz ）、低振幅（ +/-50~100mV ）、高振幅肌电图。软件分析是半自动化的，首先使用聚类评分设定，根据设定条件软件自动扫描，根据肌电图功率、 EEG 振幅和频率将一个 epoch 划分为 REM 、 NREM 或 Wake 状态。自动分析结束后对自动扫描的 epoch 进行检查，以确保每个 epoch 都根据定义进行评定，对未进行分析的 epoch 则手动根据定义评定。

- 多模态信号同步采集（EEG+ECG+EMG+体动）-

小鼠机械痛阈值的测定

所有实验小鼠均在同一行为学房间进行测试，将实验小鼠用有机透明玻璃观察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之间互相干扰）隔开，放置在金属铁丝网上，保持室内安静至少半小时以上，直到小鼠不在出现寻觅、排便等行为时开始测定。使用标准的 von Frey 纤维丝测定机械痛阈，根据预实验选取测量 Von Frey 纤维丝分别为 0.07 、 0.16 、 0.4 、 0.6 、 1 、 1.4 和 2g 。将纤维丝垂直刺激小鼠的右后脚掌心，缓慢用力直到纤维丝微微弯曲（持续 1-3s ），当小鼠突然回撤爪子或者舔脚掌的行为时记录为阳性反应。痛阈测定时从纤维丝 0.6g 开始，每个弯曲力刺激 5 次，三次或三次以上的阳性反应为阳性结果。使用 up-and-down 方法记录小鼠出现阳性结果的纤维丝对应的克数即为小鼠机械刺痛的阈值。为防止因为频繁刺激影响结果，每次间隔 1min 左右。刺激时，小鼠出现走动寻觅或者刺激一接触就出现提足行为时，需要等小鼠安静下来再进行测量。

小鼠热刺痛阈值的测定

将实验小鼠用有机透明玻璃观察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之间互相干扰）隔开，放置在热痛测定专用玻璃板上，待小鼠能静止状态时（不四处走动）开始测定。使用热痛仪激光垂直照射小鼠的右后脚掌心，当小鼠出现抬脚或者舔脚的反应则记录为阳性结果，从开始辐射热刺激到出现阳性反应时的时间为缩爪潜伏期（ Withdrawal latency ）。根据预实验调整辐射热源的强度，使正常小鼠缩爪潜伏期维持在 15s 左右，并设置切断时间为 30s 。每只小鼠进行三次实验，每次间隔 5min ，三次实验所记录时间的平均值即为小鼠的热刺痛阈值。

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EEG/EMG 记录结果(参数 )

首先对旋转棒干扰睡眠的效果进行评价。根据睡眠剥夺实施方案，持续监测记录小鼠的 EEG/EMG ，分析判断 Wake 、 NREM 和 REM 各阶段的时间。与对照组相比睡眠剥夺组 Wake 时间明显延长， NREM 和 REM 期几乎被消除。其中 Wake 期占总时间的 96.16% ， NREM 期占总时间的 3.78% ， REM 占总时间的 0.06% 。而对照组 Wake 期占总时间的 33.04% ， NREM 期占总时间的 55.12% ， REM 期占总时间的 11.84% 。此种睡眠剥夺方法可使小鼠在剥夺期处于几乎完全清醒状态， EEG 显示随着睡眠剥夺时间的延长，睡眠压力升高，小鼠进入 NREM 的尝试更多。