这读博就像跟变态谈了一场恋爱，每天看文献的心情，都要提心吊胆。今天讲的这篇文章，是复旦大学附属中山医院的代智团队的博士，发表在21.8分的Cell Mol Immunol上的，他们做的是GSDME+ 巨噬细胞的M2极化，在肿瘤微环境中的影响。我们就来看看他们都做了点什么内容吧：
他们首先对九例患抗PD1治疗的HCC（肝细胞癌）患者的组织样本，进行了转录组测序。结果显示这些患者中，对抗PD1治疗耐药的患者的HCC组织，表现出更高水平的GSDME（这个大家应该都熟悉了，GSDME和GSDMD都是细胞焦亡过程中比较关键的蛋白，通过水解，GSDME或GSDMD的N端聚合上膜形成穿孔，造成细胞焦亡，不清楚细胞焦亡的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列）。如果GSDME是通过细胞焦亡导致了HCC的抗PD1耐药，这明显很难说通。于是他们通过挖掘单细胞测序数据，对GSDME高表达的具体细胞簇进行了分析，结果发现在HCC组织中GSDME主要在恶性细胞和巨噬细胞中表达，也就是说，GSDME阳性巨噬细胞，很可能与HCC患者的抗PD1治疗耐药和不良预后有关：
由于GSDME在焦亡信号通路中的作用，他们也想看看在巨噬细胞中过表达或敲减，是否会造成巨噬细胞焦亡的影响。结果发现GSMDE在巨噬细胞中的表达，对于巨噬细胞的焦亡并没啥影响，也就是说在巨噬细胞中的GSDME可能存在有其他的功能。在得道了这样的结果后，明确了焦亡可能并不是GSDME在巨噬细胞中表达造成抗PD1耐药的作用机制，于是他们需要将原有的焦亡相关的假设进行迭代（这个过程其实就是假设迭代的过程，通过已知的信息，以及实验获得的数据，对原有的假设进行进一步的调整，也就是所谓的假设迭代，不清楚假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》）。他们首先构建了BMDM（骨髓衍生巨噬细胞）GSDME敲除的小鼠，然后提取巨噬细胞，注射到清除了巨噬细胞的荷瘤小鼠中。结果发现，敲除GSDME的巨噬细胞显著，抑制了HCC的增殖，增强了抗PD1治疗的有效性：
既然敲除GSDME的巨噬细胞会对抗PD1耐药有影响，那么具体是否会影响肿瘤的免疫微环境呢？于是他们在巨噬细胞中特异性敲除了GSDME后使用抗PD1治疗，然后对于这样的四组样本（野生型，GSDME缺失，野生型+αPD1，GSDME缺失+αPD1），进行了单细胞测序（下图中的tSNE图，和UMAP图类似，就是通过不同基因表达作为主成因形成的多维图，进行降维获得的结果，通过这样的二维图，对于不同的特征基因表达的细胞，可以在图中看到分簇，不清楚的话，可以看看《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》）。结果则显示出，巨噬细胞中GSDME的敲除，显著增加CD8+ T 细胞的浸润，降低M2极化巨噬细胞 的比例，增加CD4+ T细胞的比例：
敲除GSDME的巨噬细胞会造成微环境中M2巨噬细胞比例下降，于是他们就假设巨噬细胞的GSDME表达，可能促进了巨噬细胞的M2极化。通过体外实验的验证，他们发现，巨噬细胞敲除了GSDME之后，巨噬细胞的M2极化表型会明显抑制。IL4+IL13诱导的M2巨噬细胞极化显著增加pSTAT6 水平和M2标志物基因表达，同时降低了pSTAT1水平（STAT1和STAT6虽然同样都是JAK-STAT信号通路的关键转录因子，通过激活会形成二聚体入核启动转录，但是在巨噬细胞的极化过程中，这两种STAT的功能是不一样的，不熟悉JAK-STAT信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）。而GSDME敲除后，巨噬细胞pSTAT1和pSTAT6水平的变化减轻了，同时也降低了M2标记基因的表达。在巨噬细胞中GSDME的敲除，除了抑制巨噬细胞的M2极化之外，还抑制了HCC细胞的增殖：
那么GSDME是如何影响巨噬细胞的M2极化的呢？他们分析了敲除GSDME后下游基因表达的变化，对于DEGs（差异表达基因）分析后发现，PI3K-AKT信号通路得到了富集（PI3K-AKT信号通路是比较常见的信号通路之一，通过激活PI3K-AKT可以影响很多其他信号通路，同时PI3K-AKT信号通路也能影响巨噬细胞的M2极化，不熟悉PI3K-AKT信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下）。通过WB结果，GSDME的敲除，导致巨噬细胞中pPDPK1和pAKT的磷酸化降低。通过免疫共沉淀，他们发现GSDME能与PDPK1结合。而截段的GSDME与PDPK1的coIP结合分析，则发现GSDME的281-512位氨基酸序列片段，对于GSDME与PDPK1结合十分重要：
巨噬细胞中GSDME的敲减，并不会影响敲除PDPK1后的HCC发育，也就是说GSDME对小鼠巨噬细胞极化和HCC进展的调节作用，可能是通过PDPK1蛋白磷酸化介导的。那么AKT1在这里是否又位于GSDME的下游呢？他们敲减了AKT1后，并没有影响GSDME和pPDPK1的表达，也就是说AKT1可能位于GSDME和pPDPK1的下游。而敲减了AKT1后，巨噬细胞的极化也受到了抑制。那么这样的话，GSDME和PDPK1的结合，以及PDPK1的磷酸化，可能是位于PI3K-AKT信号通路激活的上游，而GSDME和PDPK1的结合则是关键诱因。于是他们假设如果能设计出GSDME的281-512位氨基酸片段与PDPK1的抑制药物，那么就能解决GSDME导致的巨噬细胞M2极化影响。于是他们对GSDME和PDPK1的结合位点进行了药物设计和筛选，然后找到了Eliprodil，它可以显着抑制巨噬细胞中GSDME和PDPK2之间的互作，从而抑制GSDME激活的PI3K-AKT信号通路（这个药物设计其实非常出色，他们把命题的内涵定义成了GSDME和PDPK1的结合导致了PI3K-AKT信号通路的激活，影响了巨噬细胞M2极化，也就是缩小了命题的外延，这样设计的药物避免了直接敲除GSDME或直接抑制PI3K-AKT信号通路会造成的肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题的外延和内涵，以及肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》）：
而Eliprodil在抑制了GSDME和PDPK1的结合后，不但抑制了PI3K-AKT信号通路的激活，以及巨噬细胞的M2极化，同时通过抑制GSDME介导的巨噬细胞M2极化，也提高了HCC的肿瘤免疫微环境中的抗肿瘤作用，并提高了抗PD1治疗的疗效：
最后他们形成了这样的示意图，巨噬细胞中GSDME通过结合PDPK1，促进了PDPK1的磷酸化，并激活了AKT的磷酸化，从而激活PI3K-AKT信号通路，导致了巨噬细胞的M2极化，导致肿瘤免疫微环境的变化，促进了HCC的抗PD1治疗耐药。而Eliprodil通过阻断GSDME和PDPK1的结合，抑制了巨噬细胞的M2极化，提高了HCC的抗PD1治疗的敏感性：
这篇文章其实很有意思，从抗PD1耐药的样本中，发现了GSDME的表达，而通过分析找到了GSDME在细胞焦亡以外的具体功能。最后通过设计药物，阻碍GSDME与PDPK1的结合，抑制了HCC的抗PD1耐药。总的来说，整篇文章的思路都很清晰，验证也十分得体，是一篇很不错的文章。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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